ADN

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12429 (2023) Citar este artículo

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La terapia de intoxicación por topoisomerasa tipo II (Top2) se utiliza para tratar una amplia gama de cánceres mediante la inducción de roturas de doble cadena (DSB) en células que se someten a replicación y transcripción. La prevención de la reparación de DSB mediante la inhibición de DNA-PK, un inhibidor de la unión de extremos no homólogos (NHEJ), aumenta la destrucción celular con venenos Top2 y ha llevado al inicio de varios ensayos clínicos. Para dilucidar los mecanismos celulares que conducen a la actividad sinérgica de la inhibición dual de ADN-PK/Top2, analizamos sus efectos en células cíclicas versus células no cíclicas, en esferoides 3D y en modelos de xenoinjerto. Se descubrió que la inhibición combinada de ADN-PK/Top2 no solo aumenta la destrucción celular en las células en proliferación, la población celular que suele ser más vulnerable al envenenamiento por Top2, sino también en células no proliferativas pero transcripcionalmente activas. Este efecto se observó tanto en modelos de cáncer como de tejido normal, matando más células que las altas concentraciones de etopósido solo. El tratamiento combinado retrasó el crecimiento del tumor en ratones en comparación con el envenenamiento con Top2 solo, pero también provocó una mayor toxicidad. Estos hallazgos demuestran la sensibilización de las células no cíclicas que expresan Top2β al envenenamiento por Top2 mediante la inhibición de ADN-PK. La expansión de la población de células diana del tratamiento con veneno Top2 para incluir células no proliferativas mediante combinación con inhibidores de reparación de daños en el ADN tiene implicaciones para la eficacia y la toxicidad de estas combinaciones, incluso para los inhibidores de ADN-PK actualmente en ensayo clínico.

Las enzimas topoisomerasa II (Top2) modulan la topología del ADN durante la replicación, transcripción, segregación cromosómica y recombinación del ADN. Las características de las estructuras del ADN, como el superenrollamiento, la catenación y los nudos, lo hacen difícilmente accesible para las enzimas críticas de procesamiento del ADN. Esto se resuelve mediante la unión de Top2, que corta temporalmente la hélice del ADN, "desenredando" las estructuras complejas1. El potencial de convertir estas pausas temporales en DSB permanentes convierte a Top2 en un objetivo atractivo para la terapia contra el cáncer. De hecho, las ADN topoisomerasas son los objetivos moleculares de varios agentes de quimioterapia utilizados para tratar neoplasias malignas sólidas y hematológicas.

Buzun et al.2 revisaron recientemente los mecanismos y las relaciones estructura-actividad de los agentes anticancerígenos dirigidos a Top2. Los venenos Top2, incluidos los fármacos clínicamente activos etopósido y doxorrubicina, se unen y estabilizan el complejo covalente Top2-ADN durante la replicación y transcripción y previenen la nueva ligadura de los extremos rotos del ADN. Hay dos isoformas Top2, Top2α y Top2β, que comparten una estructura primaria similar en los humanos. Si bien ambas isoformas son necesarias para la segregación cromosómica y la recombinación del ADN, Top2α se expresa altamente en células en proliferación para guiar la replicación del ADN3, mientras que Top2β tiene un papel más dominante durante la transcripción y se expresa de manera ubicua4. Cuando son atrapadas por los venenos Top2, ambas isoformas generan DSB de ADN; sin embargo, la evidencia ha demostrado que el objetivo principal de la isoforma para la citotoxicidad celular mediada por el veneno Top2 es Top2α, ya que las líneas celulares de eliminación/eliminación de Top2β no muestran ningún efecto significativo sobre el etopósido IC505. Top2α es el objetivo molecular principal para la actividad del veneno Top2 y los niveles de expresión de Top2α se utilizan como biomarcador de pronóstico para la detección de pacientes con cáncer adecuados para el tratamiento con el veneno Top26. Por lo tanto, las células en proliferación que expresan Top2α son las más vulnerables al tratamiento con veneno Top2, aunque los DSB de ADN también se introducen en poblaciones adicionales donde otras isoformas Top 2 están activas.

Las dos vías principales de reparación de DSB del ADN son la unión de extremos no homólogos (NHEJ) y la recombinación homóloga (HR). La HR ocurre durante las fases S/G2 tardías cuando las cromátidas hermanas están disponibles como plantilla de secuencia para la reparación y, en consecuencia, desempeñan un papel en la reparación de las DSB de ADN dependientes de la replicación mediadas por el envenenamiento de la isoforma Top2α. NHEJ ocurre durante todo el ciclo celular y repara las roturas del ADN ligando los dos extremos rotos del ADN. En general, NHEJ es la vía de reparación de DSB del ADN predominante en células de mamíferos, con un papel particularmente crítico para las células en etapas no proliferativas del ciclo celular7. La proteína quinasa dependiente de ADN (DNA-PK), un miembro de la familia de quinasas relacionadas con la fosfatidilinositol 3-quinasa (PIKK), ha sido identificada como un componente clave de la vía NHEJ y, por lo tanto, es un objetivo emergente para el desarrollo terapéutico8.

Recientemente, dos inhibidores de DNA-PK han mostrado efectos sensibilizantes con venenos Top2 en modelos preclínicos9,10,11,12. Ambos compuestos han progresado a ensayos clínicos: el candidato clínico de Merck M3814 con etopósido y cisplatino (NCT03116971), y el compuesto de Astra-Zeneca. AZD7648 con doxorrubicina liposomal pegilada (PLD) (NCT03907969). Los esfuerzos preclínicos identificaron efectos anticancerígenos mejorados de la combinación in vitro y en modelos animales sin investigar específicamente las poblaciones de células diana sensibilizadas a los venenos Top2 por los inhibidores de ADN-PK, ni el mecanismo de esta sensibilidad. Dada la amplia población de células que dependen de la actividad de Top2 para facilitar el acceso al ADN, todas las cuales son objetivos para la unión de los venenos Top2, es posible que la inhibición de la reparación del daño infligido por los venenos Top2 pueda resultar en toxicidad para poblaciones celulares adicionales. en relación con los efectos dirigidos a Top2α de los venenos Top2 solos. La evidencia de enfoques proteómicos ha demostrado que tanto DNA-PK como Top2β están involucrados en la regulación de la activación genética mediante la unión a factores de transcripción13,14,15, lo que proporciona una justificación adicional para investigar los efectos del envenenamiento por Top2 en combinación con la inhibición de DNA-PK en las células. en proceso de transcripción.

Nuestra hipótesis es que DNA-PK desempeña un papel clave en la reparación de DSB de ADN dependientes de la transcripción cuando Top2β es el objetivo de los venenos Top2. El impacto de agregar inhibidores de DNA-PK sería la sensibilización de células no proliferativas pero transcripcionalmente activas, ampliando la población de células muertas mediante el tratamiento con veneno Top2. Utilizando modelos experimentales que incluyen líneas celulares de tejido normal y canceroso, esferoides 3D y xenoinjertos de ratón, investigamos los efectos de los venenos Top2 solos o en combinación con los inhibidores de ADN-PK AZD7648 y M3814. Nuestros resultados muestran que la inhibición de DNA-PK da como resultado un aumento del daño del ADN y la destrucción celular en células cancerosas no proliferativas pero transcripcionalmente activas, así como en células de tejido normal tratadas con venenos Top2. Se observan efectos significativos de la combinación sobre el crecimiento tumoral; sin embargo, se observó toxicidad limitante de la dosis en modelos de ratón, lo que sugiere limitaciones potenciales para esta combinación.

HCT-116 (ID ATCC: CCL-247), A549 (ID ATCC: CCL-185), FaDu (ID ATCC: HTB-43), SiHa (ID ATCC: HTB-35), U87 (ID ATCC: HTB-14 ), y las células BT474 (ATCC ID: HTB-20) se obtuvieron de ATCC. HCT-116 PRKDC-/- se adquirió de Thermo Fisher (Nº de catálogo A29442); HCT-116 BRCA2-/- se obtuvo de Samuel Aparicio en BC Cancer Research Institute16; 48BR (CVCL-4T39) fue un amable regalo del laboratorio de la Dra. Peggy Olive en BC Cancer Research Institute. Todas las líneas celulares se mantienen en medio MEM (Gibco) suplementado con suero bovino fetal al 10% (Gibco) y al 1% (v/v). penicilina/estreptomicina (Gibco). Las células se cultivaron a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5 % humidificada y se pasaron de forma rutinaria cuando ~ 90 % de confluencia.

El etopósido se adquirió de Teva (DIN: 02080036) y se diluyó en solución salina antes de su uso. La doxorrubicina liposomal pegilada (PLD) se adquirió de Taro (DIN: 02493020). AZD7648 (n.º de cat. HY-111783) y M3814 (n.º de cat. HY-101570) se adquirieron en MedChemExpress y se formularon en 1 % de hidroxipropilmetilcelulosa/0,6 % de Tween80.

La progresión del ciclo celular y el daño del ADN se controlaron en células A549 después del tratamiento con etopósido y inhibidor de ADN-PK en los momentos indicados. Las células se fijaron en formalina al 10% (Fisher Scientific) en PBS durante 15 minutos y se permeabilizaron con Triton X-100 al 1% (BioShop Canada Inc) en PBS a 4 ° C durante 30 minutos. Luego, las células se lavaron y se incubaron durante la noche a 4 °C en PBS que contenía BSA al 0,1 % (BioShop Canada Inc) y anticuerpos γH2AX (dilución 1:1000; EMD Millipore Corp, Cat No 05-636). Se usó el anticuerpo Alexa Fluor 647 (dilución 1:2000; Invitrogen, número de catálogo A21245) para marcar los anticuerpos γH2AX y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las células se incubaron en 50 μg/ml de yoduro de propidio (Sigma-Aldrich) y 100 μg/ml de RNasa A (Invitrogen) durante 30 minutos y luego se analizaron 104 células por muestra en un citómetro de flujo BD LSR FORTESSA (BD Bioscience) usando 532 y Excitaciones de 635 nm. Las emisiones fluorescentes se recogieron con filtros de 585/42 nm y 661/16 nm. Se utilizó el software Flowjo (BD Bioscience) para el análisis de datos.

Las células monocapa se recolectaron con tripsina-EDTA al 0,25% (Gibco) y se sembraron a 4–8 x 103 células/pocillo en placas de 96 pocillos. Las células se incubaron con medio MEM con o sin FBS al 10% durante 24 h y luego se usaron varias dosis de etopósido e inhibidores de ADN-PK para tratar células con condición normal o sin suero durante 24 h. Las células tratadas se lavaron y se recolectaron con tripsina-EDTA, luego se sembraron en placas de 96 pocillos en tres diluciones diferentes (100 células/pocillo, 500 células/pocillo y 2500 células/pocillo). Después de la incubación durante 4 días, las colonias se fijaron en formalina al 1% y se tiñeron con 10 µl/ml de Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, número de catálogo B2261) durante 2 h. Se tomaron imágenes de cada pocillo mediante un microscopio de fluorescencia con un aumento de 4 × y las colonias se contaron utilizando el software Image J (Instituto Nacional de Salud) con algoritmos definidos personalizados.

Los esferoides 3D se cultivaron a granel utilizando matraces giratorios Magna Flex de 500 ml (Wheaton) agitados constantemente a 100 rpm. El crecimiento tardó ~ 3 semanas en alcanzar un diámetro de 400 a 500 µm utilizando un número de siembra inicial de 5 × 106 células. Los esferoides se cultivaron en medio MEM con FBS al 5%, glucosa 10 mM (Gibco) y penicilina/estreptomicina. Los medios se cambiaron cada 3 a 7 días durante el período de cultivo. Los matraces se mantuvieron en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2.

Cuando los esferoides alcanzaron un diámetro de ~ 400 µm, se recogieron y se dispensaron en placas de 96 pocillos de polipropileno de 2 ml de altura (Axygen). Los esferoides sedimentados se dispensaron en volúmenes de 3 a 5 µl en 1,2 ml de medio que contenía fármaco para lograr de 5 a 10 esferoides por pocillo utilizando una punta de calibre ancho (Perkin Elmer, calibre ancho-P235) con un manipulador de líquidos automatizado de 96 canales (PerkinElmer, Evolución P3). Se prepararon placas de pocillos múltiples con las diluciones de fármaco deseadas antes de agregar los esferoides. Luego, las placas se sellaron con una estera de caucho de silicona (Axygen) en una caja de guantes (Hypoxygen) con gasificación controlada de 5% de CO2, 20% de O2. Después de sellar las placas, se las hizo girar continuamente (20 rpm) con las placas orientadas sobre sus lados y se inclinaron para utilizar la burbuja de aire atrapada para mezclar y mantener los esferoides en un estado de caída libre. Los esferoides se expusieron a inhibidores de etopósido ± durante hasta 24 h antes de la recolección para criterios de valoración de criosección o supervivencia celular.

Después del tratamiento indicado, los esferoides se incubaron durante 2 h con 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) (Gold biotechnology) 100 µM para la replicación o 5-etiniluridina (UE) 1000 µM (Carbosyth China Ltd), para la transcripción antes. a la recolección para criosección y tinción basada en clics. Se recogieron esferoides de los 96 pocillos simultáneamente utilizando un cabezal de pipeteo de 96 canales, se dejaron asentar y luego se dispensaron en montones libres de líquido sobre una lámina de látex estirada de 13 × 13 cm (Rite Dent) de manera que, cuando se relajaba, el área se contraía desde el tamaño de una placa de 96 pocillos (7,5 × 13 cm) hasta un portaobjetos de microscopio (~ 2,5 × ~ 3,8 cm). Luego, las micromatrices de esferoides resultantes se congelaron inmediatamente mediante un bloque de aluminio a -30 °C colocado debajo de la lámina de látex relajada y se incrustaron en medio de corte OCT (Fisher Scientific).

Después del tratamiento indicado, se recogieron los esferoides y se transfirieron a medios nuevos sin fármacos. Los esferoides se lavaron tres veces con PBS antes de una incubación de 20 minutos con tripsina-EDTA al 0,25% (Gibco) con agitación continua a 37 °C. Después de la disociación, las suspensiones celulares se diluyeron aún más en medio nuevo con FBS al 10%. Luego se sembraron suspensiones celulares usando placas de cultivo de tejidos de 6 cm (Sarstedt, Alemania) para experimentos que produjeron más del 90% de destrucción celular, o placas de cultivo celular de poliestireno de 96 pocillos de fondo plano transparente (Corning, Costar 3595) para experimentos de baja destrucción celular. Luego, las placas de colonias de 96 pocillos se dejaron durante 45 minutos antes de colocarlas en una incubadora humidificada a 37 °C con 5 % de CO2 para permitir la sedimentación de las células; de lo contrario, se produciría una agrupación de colonias no uniforme en los pocillos externos. Después del cultivo en placas de colonias, las suspensiones celulares originales se contaron por duplicado diluyendo alícuotas de 25 µl de cada pocillo en placas adicionales de 96 pocillos de poliestireno transparente de fondo plano que contenían 25 µl de Hoechst 33342 (concentración final de 10 µl/ml) y yoduro de propidio ( 4 µl/ml de concentración final). Se permitió que las suspensiones celulares se asentaran durante 30 minutos antes de obtener imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia para el recuento inicial de células vivas/muertas. Luego se utilizaron recuentos de células para calcular el número real de células sembradas en pocillos individuales. Los recuentos se realizaron en réplicas de 2 para garantizar la reproducibilidad. Se incubaron placas de 96 pocillos durante 4 días, momento en el que se fijaron en formalina al 1% y se tiñeron con Hoechst 33342 durante 2 h y luego se tomaron imágenes de cada pocillo con un microscopio de fluorescencia con un aumento de 4X y se contaron las colonias utilizando el software Image J. con algoritmos definidos personalizados. Se incubaron placas de 6 cm durante 12 días para permitir la formación de colonias y luego se tiñeron con 2 g/l de verde malaquita (Sigma-Aldrich) en agua y se contaron manualmente.

Todos los estudios con ratones se realizaron en el Centro de Recursos Animales del Instituto de Investigación del Cáncer de BC y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Columbia Británica según el protocolo de estudio con animales aprobado A21-0059. Todos los animales fueron tratados de acuerdo con las pautas éticas del Consejo Canadiense de Cuidado Animal y se informan de acuerdo con las pautas ARRIVE 2.0. Los ratones Rag2M se compraron originalmente de Taconic Biosciences.

Para los estudios de retraso del crecimiento del tumor A549, se inocularon 106 células A549 en el músculo gastrocnemio de 61 ratones macho Rag2M de 10 a 13 semanas de edad en un volumen de 50 μL, incluido un exceso del 20% para tener en cuenta las tasas variables de crecimiento del tumor. Cuando el volumen medio del tumor de la cohorte superó los 150 mm3, los animales se estratificaron según los rangos de volumen del tumor; los animales con los volúmenes tumorales más pequeños fueron excluidos del estudio (n = 13). Los animales restantes (tamaño de cohorte de n = 48, 30 para el retraso en el crecimiento del tumor con etopósido y 18 para el retraso en el crecimiento del PLD) tenían volúmenes tumorales dentro del rango de volumen de 160 a 225 mm3. Los animales se asignaron a grupos de tratamiento mediante aleatorización estratificada y un generador de números aleatorios para garantizar que se asignara un rango de volúmenes tumorales a cada grupo. No se realizaron cálculos de potencia a priori. Se determinó que un tamaño de grupo de muestra de n = 6 era apropiado para este estudio debido a observaciones previas de una respuesta tumoral consistente a la quimioterapia y respuestas de sensibilización por inhibidores de reparación de daños en el ADN, sin numerosos valores atípicos o anomalías. Se observaron morbilidades significativas que requirieron criterios de valoración de terminación humana debido a una pérdida de peso significativa en grupos de tratamiento particulares; tamaños de muestra de grupo más grandes no habrían mejorado este resultado.

El etopósido se administró por vía intraperitoneal (ip) a 5 mg/kg los días 0, 1 y 2 de cada semana durante 3 semanas. La doxorrubicina liposomal pegilada (PLD) se administró mediante inyección intravenosa (iv) a 6 mg/kg una vez por semana durante 3 semanas. AZD7648 se administró mediante sonda oral (vo) a 10, 30 o 100 mg/kg al mismo tiempo en combinación con venenos Top2. Para los grupos de control, se administró un volumen equivalente de vehículo farmacológico. El tamaño de los tumores y el peso de los ratones se controlaron 3 veces por semana, y los volúmenes de los tumores se midieron con calibradores y se calcularon utilizando la fórmula V = π/6 (L × H × W). Las mediciones se realizaron mediante un registrador ciego. Los ratones fueron sacrificados en el punto final experimental, cuando los volúmenes del tumor alcanzaron 1000 mm3, o en el punto final humano, incluidos los animales que excedieron > 20% de pérdida de peso previo al tratamiento. Los animales que tuvieron que ser sacrificados debido al criterio de valoración humanitario se informan en los resultados del estudio. Todos los animales se mantuvieron en las mismas condiciones de alojamiento y cría, y se proporcionaron suplementos dietéticos de masa a todos los ratones experimentales durante el período de tratamiento.

Para los estudios basados ​​en inmunohistoquímica, se utilizaron un total de 18 ratones. No se realizaron cálculos de potencia a priori. Se determinó que un tamaño de muestra de n = 6 era apropiado para este estudio debido a observaciones previas de una respuesta tumoral consistente utilizando el ensayo EdU, sin numerosos valores atípicos o anomalías. Se analizan criosecciones completas de muestras de tumores para crear un conjunto de datos sólido. Se inyectaron 106 células FaDu en el gastrocnemio de ratones macho Rag2M de 13 semanas de edad y se cultivaron hasta un mínimo de ~ 300 mm3 de volumen. Se administró etopósido (40 mg/kg ip) ± AZD7648 (30 mg/kg po) 24 h antes de la recolección del tumor. 2 h antes de la recolección de tejido, se administró EdU (60 mg/kg ip). Después de la escisión, los tumores se enfriaron a –20 °C en un bloque de aluminio y se cubrieron con medio de inclusión OCT (Tissue-TEK OCT).

Se cortaron criosecciones de tumores o esferoides (10 µm de espesor) con un criostato Cryostar HM560 (Microm International GmbH), se fijaron inmediatamente en formalina tamponada con fosfato al 10% durante 15 minutos y luego se transfirieron a PBS + Tween 20 al 0,1% (PBST). La vasculatura se tiñó usando un anticuerpo CD31 (dilución 1:500; BD Pharmingen, número de catálogo 553370) durante 1 h, seguido de 1:500 Alexa-anti-rata 488 nm secundario (Invitrogen, número de catálogo A11006) durante 30 min. El daño del ADN se tiñó con 1:500 de anticuerpo p53BP1 (Cell Signaling, número de catálogo 2675S) durante 1 h, seguido de 1:500 de Alexa-anti-rata 647 nm secundario (Invitrogen, número de catálogo A21472) durante 30 minutos. Top2 se tiñó usando 1:500 de anticuerpo Top2α (Novus, número de catálogo NBP2-53281) o anticuerpo Top2β (Novus, catálogo Bo NBP1-89527) durante 1 h, seguido de 1:500 de Alexa-anti-conejo secundario de 488 nm ( Invitrogen, número de catálogo A11034) durante 30 min. Para la detección de EdU y EU, los portaobjetos se volvieron a fijar en formalina al 10 % durante 10 minutos, antes de la tinción con EdU/EU utilizando un cóctel de química click: ácido L-ascórbico (100 mM), CuSO4 (4 mM) y sulfo-Cy3-Azida. (5 µM) (Sigma-Aldrich) junto con el marcador nuclear Hoechst 33342 (20 µg/ml) durante 30 min. Todas las diluciones se realizaron en PBST. Luego se lavaron los portaobjetos durante 30 minutos y se montaron con PBS antes de la obtención de imágenes.

Las diapositivas se cargaron en un sistema de imágenes personalizado, un objetivo Nikon Plan Fluorite Imaging 10 × (Nikon), una cámara PCO Edge 4.2 sCMOS (PCO) refrigerada, ejecutada utilizando algoritmos personalizados en el software ImageJ (ImageJ, https://imagej.nih .gov/ij/). Utilizando este sistema, se capturaron imágenes de portaobjetos de microscopio completos con una resolución de 0,65 µm/píxel.

Utilizando la aplicación de software ImageJ y los algoritmos proporcionados por el usuario, se superpusieron imágenes de fluorescencia CD31, 53BP1, EdU y Hoechst 33342 de cada sección del tumor, se describieron los límites del tumor y se eliminaron áreas de necrosis y artefactos de tinción (pliegues, desgarros, desechos, etc.). ). Luego se identificaron los objetos positivos para CD31 en la capa de imagen de CD31 usando un umbral determinado como 10 desviaciones estándar por encima de los niveles de fondo del tejido. Los objetos CD31 que tenían un tamaño inferior a 10 µm2 se consideraron artefactos y se eliminaron del análisis. Luego se llevó a cabo un análisis para medir la distancia desde cada punto del tejido hasta el objeto CD31 positivo más cercano, observando su intensidad para luego determinar la relación entre la proliferación o la señal de 53BP1 en función de la distancia al vaso sanguíneo más cercano. Los datos se tabularon para determinar el perfil de tinción de EdU y 53BP1 versus la distancia a los vasos sanguíneos, o se informa la intensidad promedio de los píxeles para p53BP1. Se adoptó un enfoque similar para el análisis de esferoides, utilizando el borde exterior del esferoide como punto de referencia en lugar de los objetos CD31.

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software Graphpad Prism (versión 9.3). Las curvas de supervivencia de respuesta a la dosis del fármaco se ajustaron con herramientas de ajuste de curvas de regresión no lineal en Prism, utilizando el modelo “CI50 absoluta, X es log (concentración)”. El resumen de supervivencia y los gráficos de barras de pIC50 de etopósido se evaluaron mediante pruebas t no apareadas de dos colas. El tiempo hasta triplicar el volumen del tumor se evaluó para todos los grupos mediante ANOVA seguido de pruebas de comparaciones múltiples de Turquía. El porcentaje de pérdida de peso del ratón en los análisis del día 7/14 se evaluó mediante la prueba ANOVA de Kruskal-Wallis. Los análisis de intensidad de la señal del tumor p53BP1 se realizaron mediante pruebas t de dos colas no apareadas. Los análisis de intensidad de señal del esferoide p53BP1 se realizaron mediante ANOVA seguido de pruebas de comparaciones múltiples de Tukey. Los valores p calculados se informan como *p \(\le\) 0,05; **p \(\le\) 0,01; ***p \(\le\) 0,005; ****p \(\le\) 0,001.

Los modelos de tejido esferoide en 3D recapitulan los gradientes de oxígeno y nutrientes del microambiente del tumor sólido para dar como resultado una población de células mixtas que contiene una mayor proporción de células inactivas no proliferantes en comparación con el cultivo en monocapa, donde es más probable que las células en proliferación dominen la respuesta al etopósido. tratamiento17. En el modelo de esferoide 3D, el tratamiento con etopósido tiene una relación dosis-respuesta que se satura más allá de aproximadamente 10 µM, y aproximadamente el 40 % de las células sobreviven incluso con dosis 10 veces más altas (Fig. 1). Para dilucidar las funciones de HR y NHEJ en la sensibilización de los esferoides al daño en el ADN inducido por el veneno Top2, realizamos ensayos de supervivencia clonogénica en esferoides HCT-116 que eran deficientes en HR (BRCA2-/-) o NHEJ (PRKDC-/-) después de exposición al etopósido. Después de 24 h, los esferoides con deficiencia de HR muestran un perfil de sensibilidad al etopósido similar en relación con los esferoides HCT-116 de tipo salvaje, con aproximadamente un 60 % de muerte celular, lo que coincide con la focalización selectiva de la fracción de fase s dentro de los esferoides18, mientras que los esferoides con deficiencia de NHEJ experimentaron ~ 4 registros de muerte celular adicional. La adición de inhibidor M3814 de ADN-PK 1 µM aumentó la destrucción celular en esferoides de tipo salvaje en un factor de 10 en comparación con el tratamiento con etopósido solo. Estos resultados indican que NHEJ es la principal vía de reparación del daño en el ADN inducido por etopósido y que la inhibición de ADN-PK puede sensibilizar eficazmente a los esferoides celulares más allá de lo que pueden lograr concentraciones crecientes de etopósido por sí solo.

La anulación de la vía de reparación de NHEJ, pero no de la HR, sensibiliza los esferoides tumorales 3D al etopósido, que se satura al 50% de la destrucción celular. Fracción clonógena de supervivencia ± SD de esferoides HCT-116 de tipo salvaje, BRCA2-/- y PRKDC-/- tratados con etopósido (0, 3, 10, 30, 100 µM) durante 24 h.

El efecto de la inhibición de DNA-PK en combinación con venenos Top2 se evaluó mediante ensayos de supervivencia clonogénica realizados en cultivos celulares en monocapa tratados con etopósido ± inhibidores de DNA-PK AZD7648 o M3814. Las curvas de dosis-respuesta para las células FaDu (Fig. 2A, panel izquierdo) muestran que el tratamiento en monoterapia con AZD7648 o M3814 no tuvo efecto sobre la supervivencia hasta 10 µM; sin embargo, 1 µM de cualquiera de los inhibidores de ADN-PK en combinación con etopósido mostró una reducción significativa en la supervivencia celular. en relación con el etopósido solo. Estos datos se utilizaron para calcular los valores de IC50 de etopósido que se muestran en la Fig. 2A (panel derecho) para FaDu y líneas celulares adicionales, con valores consistentemente más bajos para AZD7648 1 µM + etopósido en relación con el veneno Top2 solo, lo que indica que los inhibidores de ADN-PK sensibilizan la monocapa. células tumorales a etopósido en al menos un factor de 10.

Los inhibidores de DNA-PK sensibilizan los cultivos celulares en monocapa al tratamiento con etopósido. (A) Supervivencia clonogénica de líneas celulares cancerosas tratadas con etopósido ± 1 M AZD7648 o 1 M M3814 durante 24 h (media ± DE). Se muestra la curva de supervivencia de las células FaDu, AZD7648 y M3814 administradas solas (panel izquierdo). IC50 ± SD de líneas celulares HCT-116, A549, FaDu y SiHa tratadas con etopósido ± 1 µM AZD7648 durante 24 h (panel derecho). Experimentos realizados al menos 3 veces. La adición de AZD7648 disminuyó significativamente la CI50 del etopósido (HCT-116: p ≤ 0,005, A549: p ≤ 0,0001, FaDu: p ≤ 0,0001, SiHa: p ≤ 0,005). (B) Evaluación del daño del ADN de las células A549 y del ciclo celular mediante p53BP1 y ensayo de tinción dual con yoduro de propidio (PI) después de 6 h de tratamiento con etopósido 10 µM ± 1 µM de AZD7648 o vehículo. Los experimentos se llevaron a cabo al menos 3 veces. Contragráficos representativos de células A549 en condiciones de control, etopósido solo y etopósido + AZD7648 (panel izquierdo). El número (cuadro) representa el porcentaje del total de celdas. Relación inmunofluorescente relativa de p53BP1 específica del ciclo celular de los grupos etopósido y etopósido + AZD7648 sobre un grupo de control (panel derecho). La diferencia sólo es estadísticamente significativa en la población G1 (p ≤ 0,01). (C) Evaluación del daño del ADN de las células 48BR y del ciclo celular mediante p53BP1 y ensayo de tinción dual con yoduro de propidio (PI) después de 4 h de tratamiento con etopósido 10 µM ± 1 µM de AZD7648 o vehículo. Los experimentos se llevaron a cabo al menos tres veces. La relación inmunofluorescente relativa de p53BP1 específica del ciclo celular de los grupos etopósido y etopósido + AZD7648 se muestra sobre un grupo de control. Las diferencias son estadísticamente significativas para todas las fases, con el mayor cambio de magnitud en G1 (G1: p ≤ 0,005; S: p ≤ 0,01; G2: p ≤ 0,05). (D) Análisis de la distribución del ciclo celular de FaDu utilizando yoduro de propidio después de 24 h de inanición sérica. Los números (sobre las barras de puerta) representan el porcentaje del total de celdas. (E) Fracción clonógena superviviente ± DE de líneas celulares cancerosas tratadas con etopósido ± 1 µM AZD7648 en condiciones de privación de suero durante 24 h. Curva de supervivencia de células FaDu privadas de suero bajo tratamiento con etopósido/etopósido + AZD7648. También se mostró el tratamiento con etopósido solo en condiciones normales (sin falta de suero) (panel izquierdo). IC50 ± SD de líneas celulares HCT-116, A549, FaDu y SiHa tratadas con etopósido ± 1 µM AZD7648 en condiciones de inanición sérica durante 24 h (panel derecho). Las diferencias de IC50 para los grupos etopósido versus etopósido + AZD7648 son estadísticamente significativas (HCT-116: p ≤ 0,005, A549: p ≤ 0,0001, FaDu: p ≤ 0,0001, SiHa: p ≤ 0,0001).

La cantidad de daño en el ADN sufrido por las células en las etapas G1, S y G2 del ciclo celular se evaluó mediante citometría de flujo basada en tinción con yoduro de propidio (PI) y análisis de tinción con p53BP1 después del tratamiento con etopósido ± inhibidor de ADN-PK AZD7648. Los resultados en células A549 (Fig. 2B) muestran un aumento en la intensidad de la señal de p53BP1 para las células cotratadas con etopósido + AZD7648 (el 78,4% de las células son positivas) en relación con el etopósido solo (el 55% de las células son positivas). El análisis específico del ciclo celular indica un aumento significativo en el daño al ADN para la combinación en relación con el etopósido solo para la población de células G1, con cambios más pequeños en las poblaciones de células S y G2 en proliferación. Se observan resultados similares con células 48BR (fibroblastos de piel humana), donde estas células normales sufrieron un daño significativamente mayor en el ADN cuando se trataron con etopósido + AZD7648 en comparación con etopósido solo, con los mayores efectos en la fase G1 (Fig. 2C).

El impacto de la inhibición de etopósido ± ADN-PK en células no proliferativas se evaluó mediante un ensayo de supervivencia clonogénica en células privadas de suero. Se incubaron células monocapa FaDu, SiHa, HCT-116 y A549 en medios sin suero durante 24 h para dar como resultado que más del 70% de las células residieran en la fase G0/1 (la línea celular FaDu se muestra en la Fig. 2D). Luego se realizaron ensayos de supervivencia clonogénica en células privadas de suero y no privadas de suero para generar curvas de dosis-respuesta para etopósido (2,5 nM – 50 µM) ± 1 µM AZD7648 durante 24 h. Los resultados muestran que las células privadas de suero son más resistentes al tratamiento con etopósido que las células no privadas de suero; sin embargo, la adición del inhibidor de ADN-PK AZD7648 volvió a sensibilizar a las células privadas de suero (Fig. 2E, panel izquierdo) en un grado similar al anterior. visto en las células sin suero (Fig. 2A, panel izquierdo). Estos resultados se repitieron en múltiples líneas celulares, donde el valor de IC50 del etopósido solo es consistentemente mucho más alto que el del etopósido en combinación con AZD7648 (Fig. 2E, panel derecho).

Para explorar más a fondo la sensibilización de las células a los venenos Top2 mediante la inhibición de ADN-PK, evaluamos esta terapia combinada en esferoides tumorales. Como se describió anteriormente, los modelos de esferoides de tejido 3D contienen una mayor proporción de células inactivas y no proliferativas en relación con el cultivo en monocapa. La Figura 3A muestra una curva de supervivencia dosis-respuesta de esferoides FaDu al etopósido, lo que indica que los esferoides son altamente resistentes al etopósido en comparación con el cultivo en monocapa; sin embargo, la adición de M3814 1 µM muestra una sensibilización más allá de los efectos máximos observados con etopósido solo. Se muestran resultados similares en líneas celulares adicionales HCT-116, SiHa y A549, donde la fracción superviviente de esferoides disminuyó consistentemente en los grupos de tratamiento combinado de etopósido 25 µM + M3814 1 µM en relación con etopósido 25 µM solo.

Los inhibidores de DNA-PK sensibilizan los esferoides de células tumorales 3D al tratamiento con etopósido. (A) Supervivencia clonogénica de esferoides de células FaDu tratados con etopósido ± 1 M M3814 durante 24 h (media ± DE). (B) Fracción de supervivencia de los esferoides HCT-116, A549, FaDu y SiHa tratados con etopósido 25 M + M3814 1 M durante 24 h (media ± DE) (p ≤ 0,0001 para todas las líneas celulares). Los experimentos se realizaron al menos 3 veces excepto para las células FaDu. (C) Imágenes representativas de la tinción de EdU, EU, Top2α y Top2β (rojo) en esferoides de células tumorales HCT-116, A549, FaDu, SiHa, U87 y BT474. Los núcleos celulares se tiñeron con Hoechst 33342 (gris). (D) Evaluación de la intensidad de la señal de EdU y EU versus la profundidad celular en esferoides HCT-116 no tratados. Las líneas discontinuas representan repeticiones de experimentos individuales, mientras que las líneas continuas representan promedios grupales. (E) Análisis de la intensidad de la señal de p53BP1 (media ± DE) a diferentes profundidades en esferoides de células tumorales (0–50 µm, 50–100 µm y 100–150 µm). Los esferoides HCT-116 se trataron con 25 µM de etopósido en presencia de M3814 1 µM, AZD7648 1 µM o vehículo durante 6 h antes de la criosección y la tinción. La adición de M3814 y AZD7648 aumentó significativamente la intensidad de p53BP1 en capas de esferoides de 50 a 100 µm y de 100 a 150 µm (p ≤ 0,01 para AZD7648, p ≤ 0,001 para M3814).

Para investigar la posible contribución de la transcripción a la respuesta de la inhibición dual de ADN-PK/Top2, se evaluó la tinción inmunohistoquímica del estado de transcripción y replicación en función de la profundidad de los esferoides 3D y estos resultados se compararon junto con los perfiles de tinción Top2α y Top2β. Los patrones de replicación del ADN y síntesis de ARN se visualizaron mediante tinción química de "clic" con EdU y EU respectivamente19,20. Nuestros resultados mostraron que tanto la tinción con Top2α como con EdU se restringieron al borde de los esferoides (<50 µm), mientras que la tinción con Top2β y EU se expresaron de manera más ubicua, extendiéndose a capas más profundas de esferoides (Fig. 3C, D). El daño al ADN también se evaluó utilizando p53BP1 en esferoides tratados con etopósido ± inhibición de ADN-PK. Cuando se expuso etopósido solo a esferoides, la tinción de p53BP1 solo se detectó en los primeros 50 µm de los esferoides, lo que coincide con un mayor daño al ADN que se produce en la fracción en proliferación de las poblaciones de células esferoides. Sin embargo, cuando se agregó AZD7648 o M3814 1 µM, el p53BP1 se extendió más hacia los esferoides (50–150 µm) donde la síntesis de ADN estaba reducida o ausente, pero donde la síntesis de ARN aún estaba activa (Fig. 3E).

A continuación, probamos la terapia de inhibición de ADN-PK con venenos Top2 ± en ratones con xenoinjertos FaDu o A549. La Figura 4 muestra el efecto antitumoral de la inhibición de ADN-PK a través de AZD7648 con los venenos Top2 etopósido o doxorrubicina liposomal pegilada (PLD) en xenoinjertos A549. El tratamiento con AZD7648 por sí solo no tuvo efecto antitumoral (Fig. 4E). La dosis relativamente baja de etopósido (5 mg/kg 3 veces/semana durante 3 semanas) tuvo poco efecto antitumoral en comparación con los controles del vehículo, y agregar la dosis más baja de AZD7648 (10 mg/kg 3 veces/semana durante 3 semanas) no produjo ningún efecto antitumoral. sensibilización. Sin embargo, se observó un retraso significativo en el tiempo hasta 3 veces el volumen tumoral con una dosis más alta de AZD7648 (30 mg/kg 3 veces por semana durante 3 semanas) con etopósido, extendiéndose a 28 días en comparación con 19 días para el etopósido solo (Fig. 4E). No se pudo completar un aumento adicional de la dosis de AZD7648 a 100 mg/kg debido a la toxicidad grave del tejido normal que requirió una terminación temprana del criterio de valoración (7 días después del tratamiento inicial). Se observa que la pérdida de peso de los ratones en los grupos de tratamiento combinado sigue un patrón dependiente de la dosis similar al de los efectos de inhibición del crecimiento, con todos los grupos experimentando una rápida pérdida de peso, y el grupo de combinación más alto de 100 mg/kg de AZD7648 superó el 20% en la primera semana (Fig. 4B, F). Esto es consistente con la sensibilidad de las células de tejido normal en relación con las células cancerosas que se muestra en cultivos en monocapa (Fig. 2C).

El inhibidor de ADN-PK AZD7648 administrado en combinación con venenos Top2 retrasa el crecimiento tumoral. (A) y (C), volúmenes tumorales relativos (media ± DE) del crecimiento del tumor A549 representados frente al tiempo. Los ratones portadores de tumores se aleatorizaron (n = 6 por grupo) con un volumen tumoral medio de 185 mm3 (SD = 17,6) y 192 mm3 (SD = 17,6), respectivamente. Para el tratamiento con etopósido (A), se administraron 5 mg/kg de etopósido por vía intraperitoneal y AZD7648 se administró por vía oral en dosis de 10, 30 y 100 mg/kg. Para el tratamiento con PLD (B), se administraron 6 mg/kg de PLD por vía intravenosa con o sin 100 mg/kg de AZD7648 administrado por vía oral. Todos los tratamientos duraron 3 semanas. (B) y (D) muestran el cambio de peso relativo de los ratones (media ± DE) de los animales con tumor A549 después de los tratamientos con etopósido y PLD respectivamente, representados en función del tiempo. (E) Tiempo de triplicación del tumor para ratones que se muestran en (A) y (C); El tratamiento con 100 mg/kg de AZD7648 solo se realizó en un estudio separado. Los puntos representan los ratones individuales de cada grupo. Hay un aumento significativo en el tiempo de triplicación del tumor para etopósido + 30 mg/kg AZD7648 (p ≤ 0,05) en relación con etopósido solo, así como entre PLD versus PLD + 100 mg/kg AZD7648 (p ≤ 0,001). (F) Porcentaje de pérdida de peso del ratón en relación con el control (media ± DE) en el día 7 para el tratamiento con etopósido. La diferencia entre los grupos de control con vehículo frente a 5 mg/kg de etopósido + 100 mg/kg de AZD7648 y 5 mg/kg de etopósido frente a 5 mg/kg de etopósido + 100 mg/kg de AZD7648 son estadísticamente significativas (p ≤ 0,01 y p ≤ 0,05 respectivamente). (G) Porcentaje de pérdida de peso del ratón en relación con el control (media ± DE) el día 14 para el tratamiento con PLD. La diferencia entre los grupos control con vehículo versus 6 mg/kg PLD y 6 mg/kg PLD versus 6 mg/kg PLD + 100 mg/kg AZD7648 son estadísticamente significativas (p ≤ 0,01 y p ≤ 0,05 respectivamente).

Los animales portadores de tumores A549 tratados con 6 mg/kg de PLD una vez por semana durante 3 semanas como agente único tuvieron un retraso significativo en el crecimiento del tumor en relación con los controles y el tiempo hasta triplicar el volumen del tumor se extendió de 19 a 48 días (Fig. 4E). La adición de 100 mg/kg de AZD7648 a PLD retrasó aún más el crecimiento del tumor a 72 días en comparación con 48 días para PLD como agente único (Fig. 4E). Se observó una toxicidad moderada en los tejidos normales tanto para el PLD solo como para el grupo combinado, ya que todos los ratones tuvieron que recibir suplementos dietéticos de masa para no exceder el 20% de pérdida de peso en los grupos de tratamiento; los grupos de control ganaron peso con la dieta de masa (Fig. 4D, G). También se observan resultados similares en xenoinjertos de FaDu (datos no mostrados).

Realizamos tinción inmunohistoquímica y análisis de tumores de xenoinjerto FaDu tratados con etopósido ± AZD7648 para examinar la ubicación del daño en el ADN y las células en proliferación en relación con la vasculatura tumoral. El tratamiento con un solo agente con una dosis relativamente alta de 40 mg/kg de etopósido indujo significativamente daño en el ADN en tumores FaDu a las 6 h. La tinción para p53BP1 se detectó principalmente en regiones donde se encuentran vasos sanguíneos funcionales (CD31) y células en proliferación (EdU) (imágenes representativas mostradas en la Fig. 5A). La adición de 30 mg/kg de AZD7648 amplió la región de células con daño positivo en el ADN, ya que la tinción de p53BP1 parece ser más intensa y ahora también se detecta en regiones con menos vasos sanguíneos.

El inhibidor de DNA-PK AZD7648 mejora los daños al ADN inducidos en tumores de xenoinjerto tratados con etopósido venenoso Top2. (A) Imágenes representativas de la tinción IHC de EdU, CD31 y p53BP1 de tumores de xenoinjerto FaDu tratados con 40 mg/kg de etopósido (ip) como agente único o en combinación con 30 mg/kg de AZD7648 (po). A las 4 h, los animales recibieron más dosis de 60 mg/kg de EdU (ip), y los tejidos se recogieron a las 6 h después del tratamiento de quimioterapia. (B) Evaluación de la intensidad de la señal de p53BP1 en función de la distancia a los vasos sanguíneos (CD31). Los controles, los grupos etopósido y etopósido + AZD7648 se indican con líneas grises, azules y verdes respectivamente. La línea continua representa el promedio de todos los experimentos, mientras que las líneas discontinuas representan repeticiones individuales. (C) El análisis cuantitativo que compara la intensidad de la señal de p53BP1 en áreas cercanas a los vasos sanguíneos (15–65 µm) y más alejadas de los vasos sanguíneos (100–150 µm) entre los grupos de etopósido solo y etopósido + AZD7648 muestra un resultado estadísticamente significativo (p ≤ 0,0001 para 15–65 µm, p ≤ 0,005 para 100–150 µm).

Nuestros resultados mostraron que la señal EdU de los tumores de control alcanza su punto máximo cerca de los vasos sanguíneos (<50 µm) y disminuye gradualmente a medida que aumenta la distancia (Fig. 5A). Esto es consistente con las características del microambiente de los tumores sólidos donde las células cercanas a los vasos sanguíneos son proliferativas mientras que las más alejadas se vuelven no proliferativas y están inactivas21,22,23. Se realizó un análisis cuantitativo para mapear la intensidad de la tinción con p53BP1 en función de la distancia a los vasos sanguíneos teñidos con CD31 más cercanos. La tinción de p53BP1 en tumores tratados con fármacos aumenta hasta un pico cerca de los vasos sanguíneos en los grupos tratados, antes de disminuir nuevamente más lejos. Sin embargo, mientras que el grupo de etopósido solo muestra que la tinción de p53BP1 regresa a los niveles de control a distancias alejadas de los vasos, la adición del inhibidor de ADN-PK AZD7648 da como resultado mayores niveles de daño persistente en el ADN marcado con p53BP1 (Fig. 5B). Se observaron aumentos significativos en la intensidad de p53BP1 entre los grupos de tratamiento único con etopósido y de combinación para las regiones "cercanas a los vasos sanguíneos" y "lejos de los vasos sanguíneos" (p \(\le\) 0,0001 y p \(\le\) 0,005 respectivamente) (Fig. .5C). Estos hallazgos sugieren que la adición de inhibidores de ADN-PK sensibiliza las células tumorales no proliferativas al tratamiento con etopósido in vivo.

En general, hemos demostrado que los inhibidores de ADN-PK sensibilizan las células al tratamiento con veneno Top2 en tres modelos preclínicos: cultivo celular, esferoides 3D y ratones con tumores. En relación con la inhibición de Top2 sola, la tinción inmunohistoquímica y el análisis de citometría de flujo indican un mayor daño al ADN en cáncer no proliferativo y en fase G1 y células de tejido normal en tratamientos cuando se combinan etopósido e inhibidores de ADN-PK. Los ensayos de supervivencia clonogénica y los estudios de retraso del crecimiento tumoral in vivo confirman que el aumento observado en el daño del ADN se traduce en una mayor destrucción celular y un retraso más prolongado en el crecimiento tumoral en tratamientos combinados en comparación con el veneno Top2 solo; sin embargo, también se observaron toxicidades limitantes de la dosis. En conjunto, estos datos demuestran que la combinación de inhibidores de ADN-PK con venenos Top2 es un enfoque de tratamiento eficaz que puede matar células tumorales inactivas y no proliferantes que de otro modo serían resistentes a los tratamientos con venenos Top2 para producir mayores efectos anticancerígenos. Sin embargo, el aumento concomitante observado en la toxicidad para las células no cancerosas sugiere la necesidad de dirigir los efectos de destrucción celular a los tejidos tumorales.

Hemos demostrado que los inhibidores de DNA-PK como AZD7648 mejoran los efectos anticancerígenos de los venenos Top2 al expandir la población de células objetivo para incluir las células no proliferantes, pero transcripcionalmente activas, que prevalecen en el microambiente tumoral.

La citotoxicidad del veneno Top2 está mediada por la captura de las proteínas Top2 en los extremos rotos del ADN, con DSB de ADN generados cuando el complejo proteína-ADN colisiona con la maquinaria de replicación o transcripción. La evidencia ha demostrado que Top2α es la principal isoforma expresada en células en proliferación para guiar la replicación, mientras que Top2β se expresa en todos los tipos de células para guiar la transcripción24,25. Ambas isoformas pueden generar DSB de ADN cuando son atrapadas por venenos Top2, aunque los mecanismos dependientes de la replicación mediados por Top2α parecen ser la principal causa de la citotoxicidad del veneno Top226,27. Nuestros resultados de daño al ADN y supervivencia celular son consistentes con estos patrones. El cultivo celular y los modelos de esferoides 3D mostraron que Top2α se expresa principalmente en células en proliferación y el tratamiento con etopósido aumentó el daño al ADN en esta población, mientras que la fracción no proliferativa es 10 veces más resistente. Además, los datos de los esferoides muestran una relación dosis-respuesta para el efecto de destrucción de células del etopósido que se estabiliza con una fracción de supervivencia significativa > 40% incluso cuando la concentración aumenta 10 veces, lo que sugiere una población significativa de células resistentes (Figs. 1, 3). .

Top2β es la otra isoforma de Top2 que se expresa tanto en células proliferantes como no proliferativas y participa principalmente en la transcripción, como se confirma en nuestros datos de esferoides. Las dos isoformas comparten el mismo mecanismo catalítico y son igualmente atacadas por los venenos Top228,29; sin embargo, la reparación de los DSB resultantes es específica del ciclo celular, con NHEJ involucrado en todas las fases del ciclo celular y HR solo activado durante la fase tardía S a G2. Nuestros datos confirman nuevamente lo que otros han demostrado, que las células en proliferación tienen una mayor sensibilidad a los venenos Top2 en comparación con las células no proliferantes, con la implicación de que las células en proliferación son menos capaces de reparar el daño relacionado con el veneno Top2. Los cánceres sólidos contienen una población mixta de células proliferantes y no proliferativas debido a la complejidad de los gradientes microambientales de suministro de oxígeno y nutrientes, de modo que las células tumorales no proliferativas distales a los vasos sanguíneos funcionales son resistentes a los efectos anticancerígenos dirigidos por Top2α30. La HR es un proceso relativamente lento pero preciso y una dosis alta de veneno Top2 puede inducir DSB en el ADN que pueden exceder la capacidad de reparación de la HR31. Los DSB inducidos durante la transcripción, por otro lado, pueden repararse más fácilmente mediante NHEJ, un proceso de reparación que es más rápido y tiene mayor capacidad en comparación con HR32. En consecuencia, las células no proliferativas tienen mayores oportunidades de reparar el daño al ADN inducido por los venenos Top2 a través de la reparación NHEJ. La evidencia de los enfoques proteómicos respalda aún más esta hipótesis al mostrar que el Top2 atrapado se elimina de los extremos rotos del ADN mediante diferentes mecanismos durante la replicación y la transcripción33,34,35. Esto da como resultado diferentes formas de DSB de ADN en el extremo 3 'entre la replicación y la transcripción (protuberancias de ADN ss 3' largas versus cortas), lo que favorece la reparación de HR y NHEJ respectivamente. La Figura 6 resume las respuestas celulares al Top2 atrapado para células en proceso de replicación o transcripción con sus destinos celulares posteriores36.

La inactividad derivada de tumores conduce a una población de células Top2 resistentes al veneno que pueden ser atacadas por la inhibición de ADN-PK. Durante la replicación, el Top2 atrapado se elimina mediante escorrentía de replicación, dejando largos salientes de una sola hebra en el extremo 3 'del ADN, lo que conduce a la clásica muerte celular provocada por envenenamiento por Top2. Durante la transcripción, el Top2 atrapado es primero degradado por el proteasoma 26S seguido de la escisión de Tdp2, dejando los DSB de ADN con dos extremos romos que pueden ser reparados eficientemente por NHEJ. La inhibición de DNA-PK bloquea la vía NHEJ, lo que conduce a un modo novedoso de muerte celular derivada del veneno Top2.

Nuestros datos proporcionan evidencia que respalda el argumento de que NHEJ es la vía de reparación crítica para que las células no proliferantes reparen los DSB del ADN introducidos por el tratamiento de intoxicación Top2. El bloqueo de la vía NHEJ con el inhibidor de ADN-PK AZD7648 sensibiliza las células tumorales al etopósido y la doxorrubicina, con el impacto más significativo en las células no proliferativas. Los datos de tinción en esferoides muestran que Top2β se expresa de manera ubicua tanto en células proliferantes como en células no proliferantes mapeadas mediante la incorporación de EdU superpuesta con el perfil de transcripción de los esferoides mapeados mediante la incorporación de EU. La adición de inhibidores de DNA-PK mejoró el daño al ADN de células tanto proliferativas como no proliferativas pero transcripcionalmente activas. Este mayor daño al ADN se tradujo en una mayor destrucción celular in vitro y un aumento de los efectos antitumorales in vivo, como lo demuestra el resultado de combinar el inhibidor de ADN-PK con venenos Top2 en ensayos de supervivencia clonogénica y retraso del crecimiento tumoral. En general, nuestra evidencia sugiere que los venenos Top2 son más efectivos para matar células incapaces de reparar el daño, que parecen ser preferentemente las células dependientes de HR en la fase S. Las células inactivas que pueden utilizar NHEJ para reparar los DSB del ADN que se producen durante la transcripción por envenenamiento con Top2β tienen menos probabilidades de morir; sin embargo, esto se puede superar con la inhibición de la proteína clave NHEJ, DNA-PK. De manera similar, también se descubrió que la inhibición de otros componentes de la vía NHEJ aumenta la citotoxicidad de los venenos Top2. Srivastava et al. ha demostrado que un inhibidor de la ligasa IV, SCR7, inhibe la vía NHEJ y confiere un mayor control tumoral cuando se trata en combinación con etopósido. Sin embargo, no se investigó el mecanismo molecular detallado que da lugar a la citotoxicidad ni a las poblaciones de células diana37.

A pesar de los importantes retrasos en el crecimiento del tumor logrados en nuestros estudios in vivo, los efectos adversos en los grupos de tratamiento combinado fueron evidentes. Como la mayoría de los tejidos normales postmitóticos tampoco son proliferativos pero transcripcionalmente activos, esta terapia combinada puede resultar en un estrechamiento del índice terapéutico para los venenos Top2, limitando el rango de dosis en las que los venenos Top2 pueden ser efectivos sin efectos adversos inaceptables. Se observaron toxicidades de moderadas a graves en nuestros grupos de tratamiento combinado, donde la dosis más alta de AZD7648 en combinación con 5 mg/kg de etopósido normalmente bien tolerado indujo una pérdida excesiva de peso durante la primera semana de tratamiento, lo que requirió la terminación humana de los animales en el estudio. La pérdida de peso podría ser el resultado de una carga excesiva de toxicidad en los intestinos, un órgano altamente proliferativo con alta sensibilidad a la quimioterapia tóxica. Se ha descubierto que la doxorrubicina liposomal pegilada (PLD) tiene una mayor especificidad dirigida al tumor debido a una vida media plasmática más larga con concentraciones máximas más bajas38. La toxicidad en los grupos de tratamiento combinado todavía se produjo con PLD, pero fue significativamente menor que la observada con etopósido. Otros grupos que combinan venenos Top2 con inhibidores de ADN-PK han informado resultados de eficacia anticancerígena similares, sin embargo, también informan toxicidad, con una pérdida de peso corporal del 15%12 y del 10%11 para los animales tratados con PLD (2,5 mg/kg) + AZD7648 ( 37,5 mg/kg) en relación con PLD solo. Sin embargo, esta toxicidad se puede superar cuando se aplica una quimioterapia más localizada, como el uso de perlas de polímero DC M1 cargadas con fármaco de quimioterapia39. Otros métodos para limitar la toxicidad y establecer una proporción terapéutica en la clínica implican un diseño cuidadoso de la programación del tratamiento y la dosificación, optimizando la destrucción de las células cancerosas y minimizando las toxicidades que limitan la dosis. Se han utilizado modelos matemáticos que incorporan el ciclo celular, el daño del ADN y la cinética de reparación para predecir la respuesta del xenoinjerto in vivo y generar esquemas de dosificación de tratamiento tolerables, como se ha utilizado en el diseño del ensayo clínico de fase I para el inhibidor de ATR AZD6738 en combinación con radioterapia40. Este enfoque también puede proporcionar una vía para una combinación eficaz de los venenos Top2 con inhibidores de reparación de daños en el ADN.

En conclusión, la adición de inhibidores de ADN-PK a los venenos Top2 introduce un efecto sinérgico con mayor impacto en las células no proliferativas, sensibilizando estas células que de otro modo serían resistentes para provocar un daño mayor o más persistente al ADN y una disminución significativa en la supervivencia de las células tumorales. Sin embargo, la sensibilización de los tejidos normales no cancerosos y las mayores toxicidades limitantes de la dosis observadas con los tratamientos combinados sugieren que es necesario un enfoque terapéutico más específico para maximizar el beneficio potencial de combinar el envenenamiento por Top2 con la inhibición de la ADN-PK.

Todos los datos sin procesar y procesados ​​estarán disponibles previa solicitud del autor correspondiente.

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Taixiang Wang, Alastair H. Kyle, Jennifer HE Baker, Nannan A. Liu, Judit P. Banáth y Andrew I. Minchinton

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TW realizó los experimentos y escribió el texto principal del manuscrito. AIM, AHK y JHEB contribuyeron al diseño de experimentos y proyectos, así como a la edición de manuscritos. JPB y NAL contribuyeron a la recopilación de datos. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Andrew I. Minchinton.

AHK, JHEB y AIM figuran como inventores en una patente y en solicitudes de patente relacionadas con nuevos inhibidores de ADN-PK. Los demás autores declaran no tener potenciales conflictos de intereses.

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Wang, T., Kyle, AH, Baker, JHE et al. La inhibición de DNA-PK extiende los efectos terapéuticos del envenenamiento por Top2 a las células que no proliferan, aumentando la actividad a un costo. Informe científico 13, 12429 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39649-7

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Recibido: 09 de mayo de 2023

Aceptado: 28 de julio de 2023

Publicado: 01 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39649-7

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