El té verde inhibió la eliminación de nefro.

Scientific Reports volumen 5, número de artículo: 16226 (2015) Citar este artículo

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La enfermedad renal crónica (ERC) es un importante problema de salud a nivel mundial. El sulfato de indoxilo (IS) y el sulfato de p-cresil (PCS) son toxinas nefrocardiovasculares altamente unidas a proteínas, que no se eliminan de manera eficiente mediante hemodiálisis. Las excreciones renales de IS y PCS estuvieron mediadas por transportadores de aniones orgánicos (OAT) como OAT1 y OAT3. El té verde (GT) es una bebida popular que contiene muchas catequinas. Estudios farmacocinéticos previos de tés han demostrado que las principales moléculas presentes en el torrente sanguíneo son los glucurónidos/sulfatos de las catequinas del té, que son supuestos sustratos de la OAT. Aquí demostramos que la ingestión de GT elevó significativamente las exposiciones sistémicas de IS y PCS endógenos en ratas con insuficiencia renal crónica (IRC). Más importante aún, GT también aumentó significativamente los niveles de creatinina sérica (Cr) y nitrógeno ureico en sangre (BUN) en ratas CRF. Los estudios del mecanismo indicaron que los metabolitos séricos de GT (GTM) inhibían las funciones de transporte de absorción de OAT1 y OAT3. En conclusión, GT inhibió la eliminación de toxinas nefrocardiovasculares como IS y PCS y deterioró la función renal en ratas CRF.

La enfermedad renal crónica (ERC) está afectando la salud de cada vez más personas en todo el mundo1. La característica principal en la etapa terminal de la ERC es la acumulación de toxinas urémicas endógenas2,3, entre las cuales el sulfato de indoxilo (IS) y el sulfato de p-cresil (PCS) están altamente unidos a proteínas y no pueden eliminarse eficientemente mediante hemodiálisis4. Además, los niveles séricos elevados de IS y PCS se asociaron con la progresión de la ERC y las enfermedades cardiovasculares (ECV), así como con la mortalidad por todas las causas5,6,7. Debido a las propiedades ácidas, IS y PCS existen como aniones bajo pH fisiológico en la circulación sistémica y los transportes de absorción de IS y PCS a través de las membranas celulares de los túbulos renales proximales fueron mediados por transportadores de aniones orgánicos (OAT) como OAT1 y OAT38. ,9,10.

Durante mucho tiempo se ha considerado que el consumo habitual de tés, hojas y brotes de Cammellia sinensis tiene muchos beneficios para la salud, como la prevención de enfermedades cardiovasculares y cánceres11,12. El té verde (GT) es uno de los tés más populares que contiene muchas catequinas como (-)-epicatequina (EC), (-)-epigalocatequina (EGC), (-)-epicatequina-3-galato (ECG) y ( −)-epigalocatequina-3-galato (EGCG), que representan hasta el 30% del peso seco de la hoja13. Estudios anteriores sobre la farmacocinética de las catequinas del té han informado que los glucurónidos/sulfatos de EC y los glucurónidos/sulfatos de EGC eran las moléculas principales en el torrente sanguíneo14,15,16. Dada la naturaleza aniónica de los glucurónidos/sulfatos a pH fisiológico, estos metabolitos conjugados de las catequinas del té son supuestos sustratos de las OAT17. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que los metabolitos séricos de GT (GTM) podrían inhibir el transporte de absorción de IS y PCS a través de la membrana celular del túbulo proximal renal mediado por OAT1 y OAT3, lo que a su vez conduciría a niveles sanguíneos elevados de IS y PCS en la ERC. pacientes con menores expresiones de OATs18,19 y en consecuencia promueven la progresión de ERC y ECV.

Aunque se ha descubierto que la GT muestra efectos protectores renales y cardiovasculares en sujetos sanos20,21,22, hasta ahora se desconoce si la GT probablemente beneficia a los pacientes con ERC. Estudios anteriores han informado que las ratas con insuficiencia renal crónica (IRC) inducida por adenina mostraron expresiones de proteínas más bajas de OAT1 y OAT3 junto con una disminución del aclaramiento de IS y PCS19,23. Por lo tanto, en este estudio se adoptó un modelo de rata CRF inducido con adenina para investigar el efecto de GT en los niveles séricos de IS y PCS endógenos. Además, también se evaluó el efecto de GT sobre la función renal de ratas CRF. Además, se utilizaron modelos celulares para verificar la participación de OAT1 y OAT3 en el mecanismo.

La infusión de GT se analizó mediante LC-MS/MS y los cromatogramas se muestran en la Fig. 1. Los resultados de la cuantificación mostraron que las concentraciones de EC, EGC, ECG y EGCG fueron 966,7, 919,9, 739,7 y 1960,1 μg/mL (3,33, 3,17 , 2,55 y 6,75 mM), respectivamente, en la infusión de GT.

Cromatogramas LC-MS/MS de EC (1), EGC (2), ECG (3), EGCG (4) y 6,7-DMC (5, estándar interno) en infusión GT.

Para imitar las moléculas que interactúan con OAT1 y OAT3 ubicadas en la membrana de las células del túbulo proximal renal, se preparó GTM a partir de ratas después de recibir una infusión de GT. La caracterización de GTM indicó que las concentraciones de las formas libres de EC, EGC, ECG y EGCG fueron 0,86, 2,17, 0,06 y 0,13 μM, respectivamente. Después de la hidrólisis con sulfatasa/glucuronidasa, todos los picos de EC, EGC, ECG y EGCG mejoraron, en particular EC y EGC, como se muestra en la Fig. 2. Las concentraciones de la forma libre y los sulfatos/glucurónidos de cada catequina del té en GTM son enumerados en la Tabla 1, que muestra que las moléculas principales en GTM eran los sulfatos/glucurónidos de EC y EGC. Las concentraciones de los sulfatos/glucurónidos de EC, EGC, ECG y EGCG fueron 32,47, 33,29, 0,13 y 0,40 μM, respectivamente, que se obtuvieron restando las concentraciones de la forma libre de aquellas después de la hidrólisis.

Cromatogramas LC-MS/MS de EC (1), EGC (2), ECG (3), EGCG (4) y 6,7-DMC (5, estándar interno) en suero antes (izquierda) y después del tratamiento con glucuronidasa/ sulfatasa (derecha).

En este estudio se establecieron y validaron los métodos analíticos de IS y PCS. Existieron buenas relaciones lineales en los rangos de concentración de 0,4–25,0 μg/mL (Y = 0,246 X + 0,006, r = 0,9999) para IS y 0,3–20,0 μg/mL (Y = 0,045 X + 0,010, r = 0,9996) para PCS en suero. La validación de los métodos analíticos para IS indicó que los coeficientes de variación (CV) del análisis intradiario e interdiario estaban por debajo del 6,4% y 7,6% y los errores relativos (RE) estaban por debajo del 12,1% y 9,9%, respectivamente. Los CV de los PCS de análisis intradiario e interdiario estuvieron por debajo del 17,0% y 12,6% y los RE estuvieron por debajo del 10,9% y 7,8%. Las recuperaciones de IS a 0,8, 3,1 y 12,5 μg/mL del suero fueron 88, 101 y 100% y las de PCS a 0,6, 2,5 y 10,0 μg/mL fueron 104, 103 y 105%. El LLOQ de IS y PCS fue de 0,4 y 0,3 μg/ml y el LOD fue de 0,01 y 0,04 μg/ml.

Los tiempos de dosificación de adenina y GT, así como el tiempo programado para la extracción de sangre, se resumen en la Fig. 3. Después de la administración de cinco dosis consecutivas de adenina, el nivel sérico medio de IS en 28 ratas se elevó significativamente de 6,85 a 15,35 μM (P < 0,001) y el nivel de PCS aumentó de 5,59 a 7,49 μM (P = 0,14) el día 4, como se muestra en la Fig. 4. Los perfiles séricos de IS y PCS endógenos en ratas CRF después de la administración oral de GT a 200 y 400 mg/kg se muestran en la Fig. 5. Los perfiles mostraron claramente que la ingestión de GT aumentó de manera dependiente de la dosis los niveles séricos de IS y PCS. Los parámetros farmacocinéticos de IS y PCS se enumeran en la Tabla 2. Los resultados mostraron que la ingestión de 400 mg/kg de GT aumentó significativamente el AUC0-360 de IS y PCS en un 139,2% y 118,4%, respectivamente, y elevó la Cmax de IS en 123,3. %, mientras que la Cmax de PCS no se vio afectada. Por el contrario, cuando se administró GT en una dosis más baja de 200 mg/kg, los perfiles de IS y PCS fueron más altos que las curvas de control; sin embargo, las diferencias de Cmax y AUC0-360 no alcanzaron significación estadística.

Hora programada de extracción de sangre (▲) y hora de dosificación de adenina y GT ( ↑).

Concentraciones séricas medias (±SE) de IS (izquierda) y PCS (derecha) en 28 ratas antes y después de la administración de siete dosis de adenina (15 mg/rata).***P <0,001.

Concentración sérica media (±SE): perfiles temporales de IS endógeno (izquierda) y PCS (derecha) después de la administración de la séptima dosis de 400 mg/kg de GT (•, n = 10), 200 mg/kg de GT (▽ , n = 8) y agua (○, n = 10) en ratas CRF.

Después de la administración de cinco dosis consecutivas de adenina, la Cr media de 14 ratas se elevó significativamente de 0,30 a 0,58 mg/dL y el BUN aumentó de 21,0 a 60,1 mg/dL el día 4. Las concentraciones de Cr y BUN en ratas CRF después administrando la séptima dosis de GT y agua se muestran en la Tabla 3. La media de Cr y BUN en el grupo GT fue de 0,79 y 55,1 mg/dL, respectivamente, que fueron significativamente más altas que las del grupo de agua (0,49 y 40,9 mg/dL).

Los efectos de GTM sobre la actividad de absorción de hOAT1 y hOAT3 se muestran en la Fig. 6. GTM en concentraciones séricas de 1/4, 1/2 y 1 veces redujo significativamente la acumulación intracelular de 6-CF, un sustrato de OAT1, en 43,9, 41,9 y 58,1%, respectivamente, en comparación con la muestra de suero en blanco en las concentraciones correspondientes. Asimismo, GTM a 1/2 y 1 veces la concentración sérica redujo significativamente la acumulación intracelular de 5-CF, un sustrato de OAT3, en un 36,4% y 31,3%, respectivamente, en comparación con la muestra de suero en blanco a la concentración correspondiente. Como inhibidores de control positivo de hOAT1 y hOAT3, el probenecid (80 μM) redujo significativamente la acumulación intracelular de 6-CF y 5-CF en un 50,4 y 50,7%, respectivamente. Estos estudios in vitro indicaron que GTM inhibió significativamente el transporte de absorción mediado por hOAT1 y hOAT3.

Efectos de GTM (concentraciones séricas de 1, 1/2 y 1/4 veces) y probenecid (Prob, 80 μM) sobre la acumulación intracelular de 6-CF en células CHO-hOAT1 (izquierda) y 5-CF en HEK293-hOAT3 células (derecha).

*P < 0,05, **P < 0,01 y ***P < 0,001.

Los resultados de la cuantificación revelaron que EGCG era la principal catequina del té en la infusión de GT, mientras que las principales moléculas en GTM eran los sulfatos/glucurónidos de EC y EGC. Estos hallazgos coincidieron en gran medida con los resultados informados anteriormente16. Con base en estos hechos, podríamos inferir que ECG y EGCG fueron hidrolizados por esterasa para formar EC y EGC, respectivamente, que luego se metabolizaron ampliamente mediante reacciones de conjugación para producir sulfatos/glucurónidos de EC y sulfatos/glucurónidos de EGC como las principales moléculas que circulan en el torrente sanguíneo.

Con respecto a la cuantificación de IS y PCS en suero, en este estudio se desarrollaron y optimizaron dos métodos de HPLC que utilizan diferentes estándares internos y longitudes de onda de detección debido a las propiedades fisicoquímicas discrepantes entre IS y PCS. La validación de los métodos analíticos confirmó que la precisión, exactitud y recuperación fueron satisfactorias para la cuantificación de IS y PCS en suero.

En el entorno clínico, los pacientes con ERC a menudo están expuestos a niveles elevados en sangre de toxinas urémicas endógenas como IS y PCS, que son subproductos del metabolismo de las proteínas24,25. Un estudio reciente informó que las concentraciones séricas de IS y PCS en sujetos sanos fueron 1,03 y 13,03 μM26. Por el contrario, para los pacientes con ERC en estadios 3-5 no hemodializados las concentraciones séricas de IS y PCS fueron de 17,45 y 73,47 μM, mientras que en aquellos pacientes con ERC en tratamiento con hemodiálisis (estadio 5D), fueron de 81,04 y 120,54 μM26. Esto resalta el hecho de que IS y PCS están altamente unidos a proteínas (89% y 96%) y, por lo tanto, no se eliminan de manera eficiente mediante hemodiálisis27,28,29,30. Con respecto a la abundancia relativa de IS y PCS en sangre, el nivel de IS se encontró consistentemente más alto que el nivel de PCS en ratas31,32,33, lo que parece opuesto al de los humanos. Esta discrepancia entre ratas y humanos podría deberse a la diferencia entre especies en el metabolismo de las proteínas23,27,34.

Para imitar la condición biológica de la ERC con menor expresión de OAT, en este estudio se utilizó adenina para inducir CRF19,23,35,36. Los niveles séricos de IS y PCS en nuestras ratas CRF se habían elevado a 15,4 y 7,6 μM, que estaban muy cerca de los valores de estudios anteriores31,32,33. Por otro lado, los niveles séricos de Cr y BUN estaban significativamente elevados, lo que indica que la función renal de las ratas estaba alterada por la adenina36,37. Después de administrar siete dosis de GT a las ratas CRF, la dosis más alta de GT de 400 mg/kg aumentó significativamente las exposiciones sistémicas de IS y PCS, mientras que la dosis más baja de 200 mg/kg no resultó en aumentos significativos, lo que indica que grandes cantidad de GT inhibió la eliminación de IS y PCS. Además, los niveles séricos de Cr y BUN aumentaron significativamente con 400 mg/kg de GT, lo que indica que GT deterioró la función renal de las ratas CRF, lo que podría explicarse por el aumento de la exposición sistémica a toxinas urémicas como IS y PCS.

Se sabía que los transportes de absorción de IS y PCS a través de la membrana celular estaban mediados por OAT1 y OAT38,9. En cuanto a las magnitudes de las influencias, fue evidente que el efecto de GT sobre los niveles séricos de IS fue mayor que el de PCS. Se ha informado que la absorción de IS por OAT1 y OAT3 fue saturable con valores de Km de 21 μM y 263 μM, respectivamente38. Con respecto a PCS, el Km para la captación mediada por OAT1 fue de 128 μM, mientras que no se observó saturación para el transporte mediado por OAT3 hasta 5 mM39. Dados los valores de Km más bajos de IS que de PCS en la absorción mediada por OAT1 y OAT3, IS debería ser un sustrato para OAT1 y OAT3 con menor capacidad. Por lo tanto, los transportes de absorción de IS mediados por OAT1 y OAT3, especialmente OAT1, se saturaron más fácilmente que los de PCS, lo que puede explicar el hecho de que GT elevó los niveles séricos de IS más que PCS.

Para explorar los mecanismos implicados, se preparó GTM para imitar las moléculas que interactúan con OAT1 y OAT340 renal,41. La caracterización de GTM demostró que las moléculas principales en el suero eran glucurónidos/sulfatos de EC y glucurónidos/sulfatos de EGC, lo que se hizo eco del hallazgo de estudios anteriores14,16. Los estudios de líneas celulares que muestran que GTM exhibe inhibición en el transporte de absorción mediado por OAT1 y OAT3 podrían explicar el aumento de los niveles séricos de IS y PCS causado por GT. Especulamos que estos mecanismos asociados con OAT1 y OAT3 en ratas con FRC podrían extrapolarse a pacientes con ERC, porque la distribución y función de los OAT en el riñón de rata son similares a las de los humanos42,43,44.

A pesar de los diversos beneficios para la salud del consumo de té en humanos sanos20,21,22, el presente estudio demostró que GT inhibió la eliminación de toxinas neprovasculares como IS y PCS y deterioró la función renal en ratas CRF. Teniendo en cuenta que los niveles sanguíneos elevados de IS y PCS aumentan el estrés oxidativo, los mediadores inflamatorios y las quimiocinas en el cuerpo45, sospechamos que consumir grandes cantidades de GT podría promover la progresión de la ERC y la ECV en pacientes con ERC. Además, debido a la eliminación ineficiente de IS y PCS mediante hemodiálisis, el consumo de GT también podría exacerbar las patologías de ERC y ECV en pacientes con ERC en etapa terminal, incluso bajo tratamiento de hemodiálisis5,6,7. Por lo tanto, sugerimos que los pacientes con ERC deben evitar beber grandes cantidades de bebidas de té antes de que se evalúen los beneficios o riesgos para los pacientes con ERC en futuros estudios clínicos. En conclusión, GT inhibió la eliminación de toxinas nefrocardiovasculares como IS y PCS mediante la inhibición de OAT1 y OAT3 y deterioró la función renal en ratas CRF.

GT se compró en el mercado de Taichung, Taiwán. IS (pureza 97%) se obtuvo de Alfa Aesar (Lancaster, Reino Unido). La 6,7-dimetoxicumarina (6,7-DMC, pureza 98%) fue suministrada por Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, EE. UU.). EC (pureza 90%), ECG (pureza 98%), EGCG (pureza 95%), ácido fórmico, probenecid, ácido fosfórico (glacial, 85%) y metilparabeno se adquirieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE.UU.). EGC (pureza 92,7%) se obtuvo de ChromaDex, Inc. (Irvine, CA, EE. UU.). y el acetato de etilo eran de calidad LC y se obtuvieron de ECHO Chemical Co. (Miaoli Hsien, Taiwán). El acetonitrilo era de grado LC/MS y se adquirió de Millinckrodt Baker, Inc. (Phillipsburg, Nueva Jersey, EE. UU.). El suero bovino fetal se obtuvo de Biological Industries Inc. (Kibbutz, Beit Haemek, Israel). Penicilina-estreptomicina-glutamina, medio Eagle modificado de Dulbecco, tripsina/EDTA, solución salina equilibrada de Hank y ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico se adquirieron de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE. UU.). El medio Eagle modificado F12 de Dulbecco se obtuvo de Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, EE. UU.). La 6-carboxifluoresceína se adquirió de AAT Bioquest Inc. (Sunnyvale, CA, EE. UU.) y la 5-carboxifluoresceína se obtuvo de Acros Organics (Geel, Bélgica). Para todas las preparaciones se utilizó Milli-Q plus agua (Millipore, Bedford, MA, EE. UU.).

La infusión se produjo macerando 2 o 4 g de GT en 50 ml de agua desionizada caliente (98-100 °C) durante 30 minutos. La infusión se filtró con una gasa mientras estaba caliente para obtener concentraciones de 40 y 80 mg/ml, respectivamente, que se administraron recién a ratas mediante sonda gástrica.

Para la caracterización de la infusión de GT, después de la filtración de la infusión de GT con un filtro RC15 de 0,2 µm (Sartorious, Goettingen Alemania), se mezclaron 100 µL del filtrado con 900 µL de metanol y se centrifugaron para eliminar el precipitado. La infusión adecuadamente diluida (50 µl) se combinó con 50 µl de solución de 6,7-DMC (2,0 µg/ml en metanol) como estándar interno y 5 µl se sometieron a análisis LC-MS/MS. El sistema HPLC incluía una bomba Accela 1250 y un muestreador automático (Thermo Fisher Scientific Inc. EE. UU.). La separación cromatográfica se logró utilizando una columna analítica Phenomenex® C18 (150 mm x 1,0 mm, 5 μm) con un prefiltro. La fase móvil consistía en acetonitrilo que contenía un 0,01 % de ácido fórmico (A) y agua que contenía un 0,01 % de ácido fórmico (B) y se programaba en gradiente de la siguiente manera: A/B: 2/98 (0–2 min), 15/85 (4 min), 40/60 (6 min), 90/10 (8-10 min) y 2/98 (12 min). El caudal fue de 0,2 ml/min. El efluente de la columna se detectó mediante una sonda H-ESI (ionización por electropulverización calentada) -II con un espectrómetro de masas de cuadrupolo de triple etapa (TSQ) Quantum Access MAX (Thermo Fisher Scientific Inc. EE. UU.). Se utilizó nitrógeno como gas envolvente en 35 unidades arbitrarias y gas auxiliar en 10 unidades arbitrarias. La energía de colisión se fijó en −19/18 V, el voltaje de pulverización en −3000/3000 V, la temperatura del capilar en 350 °C, la temperatura del vaporizador en 350 °C y la lente del tubo desplazada en −80/88 V. Se establecieron las siguientes transiciones de masa. utilizado para análisis de seguimiento de reacciones (SRM) seleccionados: EC (289/245), EGC (305/125), ECG (441/289), EGCG (457/169) y 6,7-DMC (207/151). Los espectros ESI-MS se registraron en modo de iones negativos para EC, EGC, ECG y EGCG y en modo de iones positivos para 6,7-DMC.

Se compraron ratas macho Sprague-Dawley (270–360 g) del Centro Nacional de Animales de Laboratorio (Taipei, Taiwán) y se alojaron en un ambiente acondicionado con ciclos de luz/oscuridad de 12 h. Los alimentos y el agua se adquirieron ad libitum hasta 12 h antes de los experimentos. Las ratas se dividieron en dos grupos. El primer experimento utilizó 28 ratas para determinar el efecto de GT sobre los niveles séricos de IS y PCS en ratas CRF; el segundo experimento utilizó 14 ratas para evaluar el efecto de GT sobre la función renal de ratas CRF. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (2002)" publicada por la Sociedad China de Ciencia Animal, Taiwán, República de China. El protocolo experimental había sido revisado y aprobado. el 01/08/2014 (Número de permiso: 103–126-N) por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de China, Taiwán, República de China

La IRC se indujo mediante la administración oral de adenina siguiendo estudios previos, pero con algunas modificaciones19,23,35,36. Brevemente, se administró por vía oral adenina suspendida en metilcelulosa 400 al 0,5% (15 mg/ml) a 28 ratas mediante sonda gástrica dos veces al día durante siete dosis consecutivas (15 mg/rata) durante todo el período experimental. El día 4, se determinaron los niveles séricos de IS. Al confirmar la función renal atenuada por una elevación significativa de los niveles séricos de IS, las ratas CRF se dividieron en tres grupos (8 a 10 ratas en cada grupo) con niveles de IS comparables. El primer grupo recibió 400 mg/5 ml/kg de infusión de GT dos veces al día durante siete dosis consecutivas; el segundo grupo recibió 200 mg/5 ml/kg de GT dos veces al día durante siete dosis consecutivas; y el tercer grupo recibió 5 mL/kg de agua en paralelo como control. El día 8, a las ratas se les administró la séptima dosis de GT a las 9:00 am después de un ayuno nocturno y las muestras de sangre se recogieron a los 0, 15, 30, 60, 120, 180 y 360 minutos después de la dosis. El momento programado para la extracción de sangre y las administraciones de adenina y GT se resumen en la Fig. 3. En cada momento de muestreo, se extrajeron 0,5 ml de sangre bajo anestesia con isoflurano. Las muestras de sangre se recogieron en microtubos y se centrifugaron a 10.000 g durante 15 minutos para obtener suero, que se almacenó a -20 °C antes del análisis.

Para la determinación de las concentraciones de IS y PCS en suero, se agitaron 50 µL de muestra de suero con 200 µL de metanol que contenía 10 µg/mL de 6,7-DMC o 100 µg/mL de metilparabeno como estándares internos, respectivamente, y se centrifugaron para eliminarlos. el precipitado, luego se sometió una alícuota de 20 µL a análisis por HPLC.

Para las preparaciones de calibradores, se agregaron 50 μL de suero con una serie de concentraciones de IS y PCS para lograr rangos de concentración de 0,4 a 25,0 μg/mL (1,8 a 117,3 μM) y 0,3 a 20,0 μg/mL (1,7 a 106,3 μM). respectivamente. El último procedimiento siguió al descrito anteriormente para muestras de suero. Las curvas de calibración se dibujaron mediante regresión lineal de las relaciones de área de pico (IS o PCS con respecto al estándar interno) frente a las concentraciones conocidas de IS y PCS, respectivamente.

El aparato de HPLC incluía una bomba (LC-10AT, Shimadzu, Kyoto, Japón), un detector de fluorescencia (RF-20A, Shimadzu, Kyoto, Japón) y un inyector automático (SIL-10AF, Shimadzu, Kyoto, Japón). La columna Apollo C18 (5 μm, 4,6 mm × 250 mm, Alltech, Deerfield, IL, EE. UU.) estaba equipada con una columna de protección (4,6 × 50 mm, 5 μm) (GL Science Inc., Tokio, Japón). La fase móvil consistió en acetonitrilo (A)–ácido fosfórico al 0,1% (B) y se programó en gradiente de la siguiente manera: A/B: 15/85 (0–7 min), 30/70 (9–22 min) y 15/85 (24–35 min) para IS y 16/84 (0–10 min), 30/70 (13–22 min) y 16/84 (24–36 min) para PCS. Los ajustes del detector fueron Ex 280 nm/Em 375 nm para IS y Ex 214 nm/Em 306 nm para PCS. Los caudales fueron 1,0 ml/min.

En otro experimento, se empleó el mismo protocolo animal mencionado anteriormente y se determinaron las concentraciones de Cr y BUN antes del tratamiento con adenina (día 0), antes de la dosificación de GT (día 4) y después de la séptima dosis de GT (día 8). Al confirmar la función renal atenuada por una elevación significativa de Cr y BUN el día 4, las ratas CRF se dividieron en dos grupos (7 ratas por grupo) con niveles de Cr comparables. El primer grupo recibió 400 mg/5 ml/kg de GT dos veces al día durante siete dosis consecutivas; el segundo grupo recibió 5 mL/kg de agua en paralelo como control. El día 8, a las ratas se les administró la séptima dosis de GT y agua después del ayuno nocturno y las muestras de sangre se recogieron 30 minutos después. Cr se determinó mediante un método cinético de picrato alcalino en un sistema químico ADVIA 2400 (Siemens Health Care Diagnostics, Inc. Tarrytown, NY, EE. UU.). El BUN se analizó mediante la reacción de enzima acoplada ureasa/glutamato deshidrogenasa utilizando el mismo analizador.

Construcción de líneas celulares transfectadas de forma estable utilizadas para estudios de transporte, células de ovario de hámster chino (CHO) que expresan hOAT1 (CHO-hOAT1), células de riñón embrionario humano 293 (HEK) que expresan hOAT3 (HEK-hOAT3) y su correspondiente control transfectado con vector vacío líneas celulares, se describió previamente40,41. Las células CHO se mantuvieron a 37 °C con 5 % de CO2 en medio DMEM F-12 (Thermo Fisher Scientific Inc., EE. UU.) que contenía 10 % de suero, 1 % de penicilina/estreptomicina y 1 mg/ml de G418. Las células HEK se mantuvieron a 37 °C con 5 % de CO2 en medio DMEM con alto contenido de glucosa (Thermo Fisher Scientific Inc., EE. UU.) que contenía 10 % de suero, 1 % de penicilina/estreptomicina y 50 μg/ml de higromicina B. Las células se cultivaron en Poly- Platos recubiertos con D-lisina.

Para imitar las moléculas que interactúan con las OAT in vivo, se prepararon GTM a partir de ratas y se caracterizaron. Brevemente, se administró por vía oral una infusión de GT (800 mg/10 ml/kg) a ratas en ayunas durante la noche. La sangre se recogió 15 minutos después de la dosificación de la infusión de GT. Después de la coagulación, se recogió el suero y se agitó con metanol 3 veces. Después de la centrifugación a 10.000 g durante 15 min, el sobrenadante se concentró en un rotavapor al vacío hasta sequedad. Se añadió un volumen apropiado de agua al residuo produciendo una solución con una concentración sérica 10 veces mayor, que se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 °C para su uso posterior.

Una porción de GTM se caracterizó siguiendo un método anterior con algunas modificaciones16,46. Brevemente, se mezclaron 100 μL de muestra de suero con 50 μL de sulfatasa (que contenía 1000 unidades/mL de sulfatasa y 39,861 unidades/ml de ß-glucuronidasa), 50 μL de ácido ascórbico (200 mg/mL) y se incubaron a 37 °C. durante 45 min en condiciones anaeróbicas. Después de la hidrólisis, el suero se añadió a 50 µl de HCl 0,1 N y luego se repartió con 250 µl de acetato de etilo (que contenía 100 ng/ml de 6,7-DMC como estándar interno). La capa de acetato de etilo se evaporó en atmósfera de N2 hasta sequedad y se reconstituyó con un volumen apropiado de fase móvil antes del análisis LC-MS/MS. La fase móvil consistió en acetonitrilo (A) – agua que contenía 0,1% de ácido fórmico (B) y programada en gradiente de la siguiente manera: A/B: 2/98 (0–2 min), 15/85 (4 min), 40/60 (6 min), 90/10 (8-10 min) y 2/98 (12 min). El caudal fue de 0,2 ml/min.

Se cultivaron células CHO-hOAT1 y HEK-hOAT3 (1 x 105 células/pocillo) en una placa de 96 pocillos. Se utilizaron 6-carboxifluoresceína (6-CF) y 5-carboxifluoresceína (5-CF) como sondas para evaluar el efecto de GTM sobre la actividad de hOAT1 y hOAT3, respectivamente47,48. Además, se utilizó probenecid (80 μM) como control positivo para la inhibición de hOAT1 y hOAT349. Después de 24 h o 48 h de incubación de CHO-hOAT1 o HEK-hOAT3, el medio se eliminó y se lavó tres veces con tampón PBS. Antes del experimento de transporte, las células CHO-hOAT1 y HEK-hOAT3 se preincubaron con agentes de prueba (GTM y probenecid) a 37 °C. Después de 30 minutos de incubación, se añadió 6-CF o 5-CF y se incubó durante otros 5 minutos y 10 minutos, respectivamente. Las placas se colocaron inmediatamente en un baño de hielo, se eliminaron los sobrenadantes y las células se lavaron tres veces con PBS enfriado con hielo. Posteriormente, se agregaron 100 μL de Triton X-100 al 0,1% para lisar las células y se midió la fluorescencia con excitación a 485 nm y emisión a 528 nm. Para cuantificar el contenido de proteína en cada pocillo, se agregaron 10 µl de lisado celular a 200 µl de reactivo de ensayo de proteínas diluido (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.) y se midió la densidad óptica a 570 nm. La acumulación intracelular relativa de 6-CF o 5-CF se calculó comparándola con la de los controles después de la corrección de proteínas.

La concentración sérica máxima (Cmax) se obtuvo a partir de observación experimental. El área bajo la curva de concentración sérica - tiempo (AUC0-t) se calculó utilizando la regla trapezoidal hasta el último punto. Las diferencias de IS y PCS entre tres grupos se analizaron mediante ANOVA unidireccional, mientras que la diferencia de Cr y BUN entre dos grupos se analizó mediante la prueba t de Student no apareada, tomando p <0,05 como nivel significativo. También se utilizó la prueba t de Student no apareada para el análisis de ensayos in vitro.

Cómo citar este artículo: Peng, Y.-H. et al. El té verde inhibió la eliminación de toxinas nefrocardiovasculares y deterioró la función renal en ratas con insuficiencia renal. Ciencia. Rep. 5, 16226; doi: 10.1038/srep16226 (2015).

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El trabajo fue, en parte, apoyado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología de la República de China (MOST 103-2320-B-039-025 y NSC 102-2320-B-039-014-MY2) y la Universidad Médica de China, Taichung, Taiwán. , República de China (CMU 103-N-01) y hospital de la Universidad Médica de China, Taichung, Taiwán, República de China (DMR-104-092).

Facultad de Farmacia, Universidad Médica de China, Taichung, República de China, Taiwán

Yu-Hsuan Peng, Shiuan-Pey Lin, Chung-Ping Yu, Pei-Dawn Lee Chao y Yu-Chi Hou

Departamento de Farmacéutica, Virginia Commonwealth University, Richmond, EE.UU.

Douglas H. Dulce

Departamento de Farmacia, Hospital Universitario de Medicina de China, Taichung, República de China, Taiwán

Yu Chi Hou

Departamento de Investigación Médica, Hospital Universitario Médico de China, Taichung, República de China, Taiwán

Yu Chi Hou

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Y.-HP contribuyó al diseño del estudio y a la formulación del artículo. DHS construyó las líneas celulares transfectadas y revisó el manuscrito. En el trabajo experimental participaron S.-PL y C.-PY. P.-DLC e Y.-CH contribuyeron a la concepción, diseño del estudio y supervisión del manuscrito.

Los autores no declaran tener intereses financieros en competencia.

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Peng, YH., Sweet, D., Lin, SP. et al. El té verde inhibió la eliminación de toxinas nefrocardiovasculares y deterioró la función renal en ratas con insuficiencia renal. Representante científico 5, 16226 (2015). https://doi.org/10.1038/srep16226

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Recibido: 27 de mayo de 2015

Aceptado: 12 de octubre de 2015

Publicado: 10 de noviembre de 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep16226

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Farmacocinética clínica (2017)

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