Deducción del espacio de diseño operable de RP.

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 4334 (2023) Citar este artículo

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Detalles de métricas

Se desarrolló un método RP-HPLC de fase reversa para la determinación simultánea de clorhidrato de metformina (MET), pioglitazona (PIO) y glimepirida (GLM) en sus formas farmacéuticas combinadas y plasma humano enriquecido. Se elaboraron principios de gestión de riesgos de calidad para determinar los parámetros críticos del método (CMP) y un diseño factorial fraccionado para seleccionar los CMP y, posteriormente, se empleó el diseño de Box-Behnken. Se utilizó el paradigma analítico de Calidad por Diseño (AQbD) para establecer la región de diseño operable del método (MODR) para el método desarrollado que dependía de la comprensión del perfil de calidad del producto objetivo (QTPP), el perfil analítico objetivo (ATP) y la evaluación de riesgos para diferentes factores. que afectan el rendimiento del método para desarrollar un método exacto, preciso, rentable y ambientalmente benigno. La separación se llevó a cabo utilizando una fase móvil compuesta de metanol: tampón dihidrógenofosfato de potasio 0,05 M, pH 3,7 con TEA al 0,05% (78:22, v/v). El caudal fue de 1,2 ml/min. El detector DAD se configuró a 227 nm. Se utilizó linagliptina (LIN) como estándar interno. El método propuesto fue validado según el Consejo Internacional para la Armonización de Requisitos Técnicos para Productos Farmacéuticos de Uso Humano (ICH). Los resultados del ensayo obtenidos mediante el método desarrollado se compararon estadísticamente con los obtenidos mediante el método HPLC informado y se observó una concordancia satisfactoria.

La diabetes es uno de los problemas de salud que se propagan rápidamente en Egipto y tiene un impacto sustancial en la morbilidad, la mortalidad y los problemas de atención sanitaria1. La Federación Internacional de Diabetes (FID) considera a Egipto como el noveno país del mundo con mayor número de diabéticos.

La metformina (MET, Fig. S1a) es una biguanida, un fármaco antidiabético oral2 para el tratamiento de la diabetes tipo II3. Reduce la producción de glucosa en el hígado y minimiza los niveles de triglicéridos y colesterol3.

La pioglitazona (PIO, Fig. S1b) es de tipo tiazolidinediona, también llamada "glitazonas"4. Las tiazolidinedionas son agonistas del receptor activado por proliferador de peroxisomas (PPAR-gamma) que se utilizan para el tratamiento de la diabetes tipo II. Se sabe que la pioglitazona es activa en el control de la glucemia al reducir la resistencia a la insulina4. Se utiliza solo o en combinación con medicamentos antidiabéticos. La adición de PIO a MET y/o secretagogos de insulina como parte de la triple terapia oral en pacientes con diabetes (tipo II) o en caso de falla binaria de medicamentos es esencial para alcanzar los objetivos de glucemia, mejorar la función de las células β y minimizar los factores de riesgo involucrados en la aterosclerosis5 . La PIO también mejora la hemoglobina glucosilada A1c (HbA1c) y la glucosa plasmática en ayunas (FPG)5.

La glimepirida (GLM) (Fig. S1c) es un antidiabético oral de acción prolongada que se utiliza para disminuir el nivel de azúcar en sangre6. GLM se utiliza únicamente para el tratamiento de la diabetes tipo II. GLM puede usarse con insulina u otros medicamentos para obtener un mejor control de los niveles de azúcar en sangre6.

Se informaron diferentes enfoques analíticos para la estimación de MET7,8,9,10,11, PIO12,13,14,15,16 o GLM17,18,19,20,21 solos y en combinaciones (MET y PIO)22. 23,24,25,26,27, (MET y GLM)28,29,30 y (PIO y GLM)31,32.

Las tabletas Tribet-1 y Tribet-2 se componen de (500 mg de MET, 15 mg de PIO y 1 mg de GLM) y (500 mg de MET, 15 mg de PIO y 2 mg de GLM), respectivamente33. Estos agentes son eficaces para pacientes que requieren múltiples agentes para reducir sus niveles de glucosa en sangre.

Los métodos cromatográficos son bien conocidos por su superioridad a la hora de separar y cuantificar componentes en sus mezclas complejas34. Los métodos cromatográficos con guiones tienen la ventaja adicional de mejorar la sensibilidad y selectividad del método mediante el uso de técnicas espectroscópicas avanzadas para detectar y cuantificar componentes35,36,37. Se han informado varios métodos analíticos para el análisis simultáneo de esta triple mezcla antidiabética, incluidos los métodos RP-HPLC33,38,39,40,41, LC-MS-MS30 y HPTLC42.

Los métodos RP-HPLC informados33,38,39,40,41 tenían algunos inconvenientes, entre ellos; metodologías cuestionables y/o falta de parámetros de validación satisfactorios. El método informado33 omitió algunos parámetros de validación (LOD y LOQ), así como parámetros de idoneidad del sistema (resolución), además de un MET (NTP) muy bajo33. Los métodos informados38,40 tenían una separación de alta velocidad y un tiempo de ejecución corto incompatible con los valores de resolución informados38,40. Además, el método informado37 no identificó todos los detalles del análisis de regresión38. Los métodos informados33,38,39 no se centraron ni en la evaluación del verdor ni en la aplicabilidad de las muestras biológicas. En el método informado39, el pico de MET apareció antes que el pico de plasma, y ​​el tiempo de retención del pico de plasma en muestras enriquecidas no coincidió con el del cromatograma de plasma en blanco. Ninguno de los métodos informados33,38,39,40,41 utilizó IS en sus cálculos.

AQbD es un método sistemático y basado en la evaluación de riesgos destinado a encontrar y reducir las fuentes de variabilidad que pueden conducir a una solidez deficiente del método analítico y confirmar que el método cumple con los requisitos de desempeño previstos43. En los modelos de calidad analítica por diseño (AQbD), el “espacio de diseño” se basa en el propósito previsto del método analítico desarrollado que permite su desempeño con cambios permitidos.

El enfoque actual de AQbD depende del estudio del perfil de calidad del producto objetivo (QTPP), el perfil analítico del objetivo (ATP) y la herramienta de evaluación de riesgos para factores o parámetros críticos del método (CMP) que afectan el rendimiento del método43. El objetivo (ATP) era establecer y validar una técnica de RP-HPLC robusta, sensible y ecológica. La determinación de (ATP), los atributos críticos de calidad (CQA) y los parámetros críticos del método (CMP) es uno de los pasos esenciales en el desarrollo de métodos. Los diagramas de Ishikawa como herramientas de evaluación de riesgos pueden ayudar a identificar el impacto de diferentes CMP en los CQA.

El Diseño de Experimentos (DOE) utiliza técnicas estadísticas multivariadas con ventajas, como la disminución en el número total de ejecuciones experimentales necesarias. El DOE permite el establecimiento de modelos matemáticos utilizados para evaluar la significancia estadística de diferentes efectos entre muchos parámetros triviales para determinar los pocos vitales. unos 44.

Este artículo representa el primer método HPLC para la determinación simultánea de los fármacos citados basándose en los méritos de la técnica AQbD durante el desarrollo y la optimización. Por lo tanto, el método propuesto supera a los métodos informados anteriormente para determinar la mezcla triple estudiada, particularmente para la concentración de GLM en una relación de forma de dosificación difícil. (1:15:500) (GLM: PIO: MET). El artículo se centró en especificar el dominio del espacio experimental, donde los criterios de intervalo de tolerancia para los parámetros cromatográficos estudiados se cruzan para obtener la región de diseño operable del método (MODR). Se puede considerar que la técnica amplía las aplicaciones del método en muestras biológicas agregando el estándar interno a los compuestos analizados.

MET (99,00%), LIN (99,7%), PIO (99,5%) y GLM (99,7%). Los excipientes incluyeron hipromelosa microcristalina, celulosa, estearato de magnesio, hidroxipropilmetilcelulosa, almidón pregelatinizado, lactosa monohidrato, croscarmelosa sódica, almidón pregelatinizado y dióxido de silicio coloidal. Todos los materiales utilizados en el experimento fueron obsequios de Sigma para industrias farmacéuticas (Zona Industrial de Moubarak, Quesna-Menoufia-Egipto). Las muestras de plasma humano fueron amablemente proporcionadas por el centro del banco de sangre del Hospital Universitario de Tanta después de que se realizaron los procesos requeridos. Todos los métodos se llevaron a cabo según las directrices y regulaciones pertinentes.

Las formas farmacéuticas del mercado egipcio son Amaryl M 2/500 (2 mg de glimepirida y 500 mg de metformina) con número de lote: 2/2024 de SANOFI AVENTIS-HANDOK Pharmaceuticals, Bioglita Plus (15/500) con número de lote: 200061 producida por Al Andalous para Pharmaceutical Ind. (15 mg Pioglitazona y 500 mg Metformina) y Piompride 30/4, Número de lote: 191294, AVERROES PHARMA-Egipto (30 mg Pioglitazona y 4 mg Glimepirida).

Se adquirió metanol de calidad HPLC en (Fisher, Reino Unido). Fosfato dihidrógeno de potasio obtenido de (Inter. Trade Co., Japón). El ácido ortofosfórico de calidad analítica se adquirió en (Sigma-Aldrich, Alemania). Se adquirió TEA de calidad HPLC (Oxford Laboratory, Reino Unido).

Sistema Dionex UltiMate 3000 RS (Thermo Scientific™, Dionex™, Sunnyvale, CA, EE. UU.) con inyector de muestreador automático RS, detector de matriz de diodos RS, bomba RS cuaternaria y compartimento de columna RS termostatizado. Para la adquisición de datos se utiliza el software ChromeleonR 7.1. Vortex (A & E, Reino Unido) y Hettich Centrifuge (Tuttlingen, Alemania). Un pH-metro HANNA (EE.UU.). Software Design-Expert versión 11 utilizado para el Diseño de Experimentos (DOE).

Los CMP calificados a partir del diseño de selección se probaron en diferentes niveles utilizando el diseño de optimización Box-Behnken. Los valores del CAA se utilizaron para evaluar las condiciones cromatográficas óptimas mediante una técnica matemática utilizando el algoritmo de deseabilidad de Derringer dentro del MODR predeterminado utilizando los niveles que mejor logran los criterios del intervalo de tolerancia para los parámetros cromatográficos estudiados. La separación se llevó a cabo utilizando metanol: tampón dihidrogenofosfato de potasio 0,05 M que contenía trietilamina al 0,05 % (78:22, v/v) como fase móvil. El pH del tampón se ajustó a pH 3,79 utilizando ácido ortofosfórico. Detección a 227 nm mediante DAD. Se utilizó un caudal de 1,2 ml/min.

Se prepararon soluciones madre (1000 µg/ml) para los tres fármacos (MET, PIO, GLM) y para el estándar interno (LIN) pesando 100 mg de cada uno, luego se transfirieron a cuatro matraces volumétricos de 100 ml separados y se diluyeron con metanol. almacenado a 4°C en el frigorífico. Posteriormente, se realizaron diluciones adecuadas de cada solución madre para preparar soluciones estándar de trabajo para obtener 50 µg/mL de MET, LIN y PIO y 40 µg/mL de GLM utilizando la fase móvil.

Se transfirieron diferentes volúmenes de las soluciones estándar de trabajo previamente preparadas a matraces volumétricos de 10 ml separados con un volumen constante de LIN (IS) (20 µl) y los volúmenes se diluyeron utilizando la fase móvil. Se realizaron diluciones para obtener soluciones que cubran el rango de trabajo dinámico de 0,05 a 30,00 µg/ml de PIO, de 0,05 a 500,00 µg/ml de MET y de 0,04 a 20,00 µg/ml de GLM. Se inyectaron 10 µL de cada solución y la separación se realizó utilizando las condiciones de separación mencionadas anteriormente. Las curvas de calibración se construyeron trazando la relación promedio del área del pico a (0,1 µg/ml LIN) frente a la concentración, y se calcularon las ecuaciones de regresión.

Se prepararon diferentes concentraciones en plasma humano enriquecido utilizando soluciones estándar de trabajo (50 µg/mL) del estándar interno (LIN) y los fármacos antidiabéticos considerados. La construcción de curvas de calibración se realizó trazando la relación promedio del área del pico a (0,10 µg/ml LIN) frente a las concentraciones correspondientes de fármaco en muestras de plasma humano enriquecidas que cubren el rango de trabajo dinámico de 0,04 a 2,00 µg/ml de GLM y 0,05 a 2,00 µg. /mL MET y PIO.

Antes del análisis, se permitió que la muestra de plasma humano congelada se descongelara y se equilibrara a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 h. Usando un vórtice de pulsos múltiples a 2000 rpm, el plasma descongelado se agitó durante 30 s para confirmar la mezcla homogénea y del pozo del contenido de la muestra. En un tubo de centrífuga, se coloca una alícuota de 100 µL de plasma en blanco, una alícuota diferente de la solución estándar de trabajo de 50 µg/mL de cada fármaco. Las soluciones obtenidas se completaron usando metanol hasta 5 ml y se agitaron a 2000 rpm dos veces para mezclar durante 30 s para asegurar la precipitación de proteínas. Las soluciones de muestras de plasma obtenidas se centrifugaron durante 30 minutos a 4000 rpm. De cada sobrenadante, se tomó 1 ml en un matraz volumétrico de 5 ml y las soluciones se diluyeron usando fase móvil hasta 5 ml. Luego se usó un filtro de jeringa de acetato de celulosa (0,45 µm) para filtrar todas las soluciones preparadas. Se inyectó una alícuota de 10 µl de cada solución en las condiciones de separación indicadas anteriormente.

Las tabletas Tribet 2 XR contienen (2 mg de GLM, 15 mg de PIO y 500 mg de MET) por tableta33 y no están disponibles en los mercados egipcios. Se prepararon y utilizaron tabletas sintéticas simuladas para análisis, con respecto a la preparación de tabletas preparadas en laboratorio45. La fórmula por cinco comprimidos se diseñó pesando 2,5 g de MET, 75 mg de PIO y 10 mg de GLM con los siguientes excipientes: 614,4 mg de celulosa microcristalina, 35 mg de estearato de magnesio, 75 mg de hipromelosa, 75 mg de hidroxipropilmetilcelulosa, 568 mg de almidón pregelatinizado, 740 mg de lactosa monohidrato, 45 mg de croscarmelosa sódica y 10 mg de dióxido de silicio coloidal. En un matraz aforado de 100 ml, se transfirió un peso equivalente a una tableta y se disolvió con 70 ml de metanol. La solución obtenida se sonicó durante 20 minutos, se enfrió y se completó hasta la marca usando el mismo disolvente. La solución obtenida se filtró y los residuos se lavaron. Se realizaron diluciones seriadas para preparar diferentes concentraciones de los tres fármacos.

Se pesaron, trituraron y pulverizaron diez tabletas de Amaryl M 2/500, Bioglita Plus o Piompride Tablets en tres morteros separados. En matraces volumétricos de 100 ml separados, se transfirieron y disolvieron pesos de polvo equivalentes a (500 mg de MET y 2 mg de GLM), (15 mg de PIO y 500 mg de MET) y (15 mg de PIO y 2 mg de GLM) usando 75 ml de metanol. , respectivamente. Las soluciones se sonicaron durante 15 minutos, se enfriaron y se completaron hasta el volumen usando el mismo disolvente. Se filtraron las soluciones y luego se lavaron los residuos. Se realizaron diluciones para lograr diferentes concentraciones de los dos fármacos a través de las tres formas farmacéuticas.

El primer paso en el método AQbD fue determinar el (QTPP) del producto farmacéutico final, y luego se identificó el (ATP) con base en el (QTPP) previamente determinado. Posteriormente, la determinación de (CQA) depende de los ensayos iniciales y la revisión de la literatura.

Se realizó un análisis de riesgos para delinear y determinar las CQA que podrían afectar la eficiencia y el rendimiento del método. El diagrama de Ishikawa como herramienta de evaluación de riesgos puede ayudar a definir el impacto de diferentes parámetros críticos del método CMP en los CQA46.

Este artículo tiene como objetivo separar y analizar los tres fármacos antidiabéticos con resolución y selectividad óptimas y un tiempo de ejecución mínimo sin interferencia de compuestos de matriz endógena.

Se dibujó el diagrama de espina de pescado o de Ishikawa para determinar los parámetros significativos (CMP) que afectan el rendimiento del método RP-HPLC. El diagrama de Ishikawa muestra diferentes factores que podrían considerarse (temperatura de la columna, longitud de la columna, caudal, tipo de disolvente orgánico, porcentaje de disolvente orgánico, volumen de inyección, detector, tipo de tampón, concentración del tampón y pH del tampón). Posteriormente, se realizaron ensayos preliminares para seleccionar los factores altamente críticos que se incluirían en el diseño de detección (siguiente paso).

Se calificaron cinco factores que afectan de manera más destacada el rendimiento del método (caudal, porcentaje de metanol (%MeOH), temperatura de la columna, pH del tampón y concentración del tampón).

La selección es una etapa crítica en AQbD para caracterizar los factores críticos o significativos antes de avanzar hacia el diseño de optimización. El diseño factorial completo para cinco factores de dos niveles para la fase de selección dará como resultado 25 = 32 experimentos (un número enorme), por lo tanto; Se llevó a cabo un diseño factorial fraccionado (FFD) con resolución V (25–1 = 16 experimentos) para disminuir el número de ensayos durante la optimización y el desarrollo de un método analítico para caracterizar la influencia de diferentes CMP en los CQA seleccionados. Los coeficientes de regresión de los CMP estudiados se determinaron utilizando un modelo matemático obtenido del diseño que consta de efectos de interacción principales y posibles (Ec. 1) para cada uno de los siguientes:

Cinco respuestas o (CQA): Resolución-1 entre MET y LIN (Rs-1), factor de capacidad-1 de MET (K′1), Resolución-3 entre PIO y GLM (Rs-3), factor de capacidad-4 de GLM (K′4) y asimetría MET (assym-MET).

donde β0, βi y βij representan los coeficientes para cada efecto principal y de interacción, n es el número de CMP, X es el factor examinado, Y es la respuesta medida y ε representa los residuos del modelo.

Los factores insignificantes se pasarían por alto y se mantendrían constantes durante la optimización. Los niveles más favorables de CMP obtenidos del diseño de detección se determinaron mediante una optimización adicional utilizando la metodología de superficie de respuesta. Los tres CMP significativos (pH del tampón, caudal y% de MeOH) fueron optimizados mediante Box-Behnken Design con tres niveles para detectar los niveles más favorables de cada parámetro. El diseño estuvo compuesto por un total de 17 experimentos (5 centrales + 12 no centrales) para considerar los errores experimentales. El procedimiento de optimización se basó en seis CQA denominados: resolución-1 (Rs-1: MET y LIN), factor de capacidad-1 (K′1), resolución-3 (Rs-3: PIO y GLM) y factor de capacidad-4 ( K′4), número de placas teóricas de MET (NTP-MET) y GLM (NTP-GLM).

El MODR se determinó con base en los modelos de regresión y utilizando el mismo software con una estimación de la probabilidad de falla. Se cumplen todos los criterios establecidos en el ATP dentro de la región de diseño.

Con base en el intervalo de tolerancia (TI) de los CQA con el Sigma (S) adecuado y el delta aceptable (d), los CQA designados se predijeron y representaron con la proporción de 0,90 (unilateral) y probabilidad (α) = 0,05. El dominio del espacio experimental que cruza los criterios del intervalo de tolerancia (TI) se definió como el MODR del enfoque HPLC establecido. Los modelos de algoritmos de deseabilidad de Derringer aplicados para sugerir los niveles más óptimos de cada CMP dependen de los criterios de optimización definidos.

La determinación de QTPP se basó en el sistema de administración, se debe tener en cuenta la vía de administración, el tipo de forma farmacéutica y la estabilidad de los fármacos estudiados47,48. Se identificó ATP dependiendo del QTTP determinado para obtener una técnica analítica de RP-HPLC más eficiente capaz de identificar y determinar todos los API dentro de un rango aceptable (98-102), tiempos de retención adecuados, picos simétricos y agudos y especificidad razonable. La selección de (CQA) se realizó en función de ensayos preliminares y una revisión de la literatura.

La evaluación de riesgos se basó en el diagrama de espina de pescado o de Ishikawa, figura S2, que se construyó teniendo en cuenta conocimientos científicos anteriores y ensayos preliminares. Los estudios preliminares se realizaron probando diferentes caudales, columnas, fase acuosa, proporciones de fase móvil y modificadores orgánicos. Según los resultados de los ensayos preliminares, hubo algunos problemas relacionados con la asimetría máxima de (MET) y la resolución entre (MET y LIN) y (PIO y GLM). Se requirió considerar la sensibilidad del método al GLM de la concentración más baja en la forma farmacéutica analizada. La asimetría de los picos está fuertemente influenciada por el pH del tampón, la temperatura de la columna, el tipo y el porcentaje de modificador orgánico, mientras que el caudal podría afectar la resolución, la forma y el área de los picos.

Se utilizó una lista de los parámetros más críticos observados en los ensayos preliminares como factores o CMP para el diseño de detección (A: % MeOH, B: caudal, C: temperatura de la columna, D: pH del tampón y E: concentración del tampón). La fase de selección se basó en cinco CQA: Rs-1, Rs-3, K′-1, K′-4 y Asym-MET.

Debido a la gran variabilidad de los componentes de las formas farmacéuticas tripletes analizados y los binarios (500 mg MET, 15 mg PIO, 2 mg GLM), fue necesario un compromiso al seleccionar la longitud de onda de detección utilizando el detector DAD. Se seleccionó la longitud de onda de 227 nm donde la intensidad de la señal GLM era máxima. Por el contrario, la intensidad de la señal MET fue baja para permitir la detección simultánea de ambos fármacos (MET y GLM) en esta proporción. LIN fue seleccionado como IS de elección; Se utilizó la concentración de 0,1 µg/mL para el plasma y 5 µg/mL para la separación y análisis en forma pura.

Los procedimientos que se han seguido para determinar los CMP que afectaron significativamente a cada respuesta (CQA):

Inspección del diagrama de Pareto, gráficos de probabilidad media normal y luego selección de los términos significativos del modelo.

Inspección de estadísticas de ajuste (R2 y R2 ajustado).

Interpretación de ANOVA con inspección de residuos del modelo y significancia de los factores.

Interpretación de coeficientes de ecuaciones de predicción según signo y magnitud.

Inspección de la integridad de los gráficos de diagnóstico ANOVA.

Caracterización del desempeño de factores significativos con base en los gráficos del modelo desarrollado.

Un gráfico de probabilidad medio normal es una herramienta gráfica que utiliza estos efectos estimados ordenados para ayudar a evaluar qué factores son esenciales y cuáles no son importantes. Muestra los valores absolutos del |efecto| estandarizado. de mayor a menor. El |efecto| estimado de un factor insignificante se asignó a aquellos en o cerca de la línea cero, mientras que el |efecto| estimado de un factor esencial fue asignado a los que estaban fuera de línea. Posteriormente, la confirmación por la magnitud del valor F y el valor p correspondiente a partir de los resultados de ANOVA y la magnitud y el signo de los coeficientes de la ecuación de predicción. El signo positivo de cada coeficiente de parámetro indicó que un efecto del parámetro favorece la respuesta, mientras que un signo negativo sugirió una relación inversa entre el parámetro y la respuesta. La Tabla S1 representa los resultados experimentales de los 16 experimentos de selección de diseño factorial fraccional. Los resultados de ANOVA calculados para cada respuesta, como el valor p junto con los coeficientes de respuestas estimados superiores a 0,9, se presentaron en la Tabla 1 y se concluyó lo siguiente:

Resolución-1 entre picos (MET y LIN) (Rs-1):

(Rs-1) se vio afectada por tres factores (A, C y D); El % de MeOH (A) tuvo el efecto más importante y significativo, mientras que la temperatura (C) tuvo el menor efecto. El aumento de A y C disminuyó (Rs-1). (Figura 1a). Por el contrario, al disminuir (D) disminuyó (Rs-1).

La probabilidad media normal traza un diseño factorial fraccionado (FFD).

Resolución-3 entre picos (PIO y GLM) (Rs-3):

(Rs-3) se vio fuertemente afectado por el pH del tampón (D), el %MeOH (A) y la temperatura de la columna (C), con el efecto negativo de todos. Entonces, aumentar el pH del tampón hasta pH 5 condujo a una fuerte disminución en el valor de Rs-3. Hubo una interacción de factores entre factores (A&D) (Fig. 1b).

Se realizó una caracterización adicional de los CMP impactados en cada CQA mediante la inspección de gráficos de interacción que son una herramienta muy útil para calificar los parámetros importantes y seleccionar los niveles constantes adecuados para los excluidos. Mediante la inspección del gráfico de interacción (A&D) (Fig. S3), el valor de Rs-3 superior a 2 se podría lograr con un pH del tampón (3) con un% de MeOH del 78%.

Asimetría MET (Assym-MET):

La asimetría de MET se vio afectada positivamente tanto por el %MeOH (A) como por el pH del tampón (D). Entonces, la disminución del% de MeOH (A) o del pH del tampón (D) condujo a una disminución en la asimetría de MET.

La asimetría de MET fue la única respuesta que se vio afectada por la concentración del tampón (E) con un efecto negativo. Entonces, para disminuir el valor de asimetría de MET, la concentración del tampón debe usarse en el nivel alto de 0,05 M. Por lo tanto, se tomó la decisión de mantener la concentración del tampón (E) constante en (0,05 M) durante el paso de optimización del método (Fig. .1c).

Factor de capacidad-1 (K′-1):

(K′-1) se vio fuerte y negativamente afectada por el caudal (B). (K′-1) también se vio afectado positivamente por el% de MeOH (A), pero en muy pequeña medida en comparación con el efecto del caudal (B) (Fig. 1d).

Factor de capacidad-4 (K′-4):

K′-4 se vio afectado negativamente por el% de MeOH (A), el pH del tampón (D), el caudal (B) y la temperatura (C), con diferentes magnitudes (Fig. 1e).

Después de la inspección de los resultados del diseño de detección, los pocos factores vitales que se optimizarán (A: MeOH %), (B: caudal) y (D: pH del tampón) se calificaron para el paso de optimización debido a sus efectos más fuertes. Por otro lado, los factores (E: concentración de tampón) y (C: temperatura de la columna) se mantuvieron constantes a 0,05 M y 25 °C, respectivamente. Una configuración de baja temperatura permitirá un procedimiento de separación más ecológico, y una alta concentración de tampón es esencial para controlar la asimetría del pico MET. La necesidad de una estrategia de optimización surgió como resultado del requisito de la configuración del factor variable de mejorar cada respuesta medida individualmente, lo que implica no linealidad, que se describe mejor mediante el uso de diseños de optimización de superficie de respuesta de tres niveles.

El propósito del enfoque AQbD es definir y delinear el (MODR), que es una combinación e interacción multidimensional de variables de entrada y factores de proceso que se han establecido para garantizar la calidad del método47. En otras palabras, es la región de (CMP) que cumple con los (CQA). Utilizando la estrategia del DoE, se exploró el espacio de conocimiento inicial y se determinó MODR donde se cumplen los criterios establecidos en el ATP en un nivel de riesgo definido47.

Se eligió un diseño Box-Behnken para evaluar las influencias de los tres CMP calificados (% de MeOH, caudal y pH del tampón) en los CQA seleccionados (Tabla S2). En la fase de selección, notamos en la ejecución n.° 9 (Tabla S1 y Fig. S4) que se produjo una superposición severa de los dos últimos picos cuando se utilizaron los niveles superiores de los cinco factores. El diseño de Box-Behnken con 17 ejecuciones (Tabla S2) fue más adecuado porque evita la combinación de los niveles superiores de todos los factores simultáneamente y eso se ajusta a nuestro propósito de optimización.

Todos los modelos desarrollados fueron cuadráticos y las variables se comportaron de forma no lineal; esto puede indicarse mediante términos de orden superior (x2). Además, los modelos mostraron valores R2 y R2 ajustados altos de más de 0,9, como se muestra en la (Tabla S2) y una falta de ajuste insignificante en relación con los valores de error puro, donde todos indicaron un buen ajuste del modelo. Mediante la inspección de los coeficientes del modelo obtenidos (Tabla 2) y las superficies de respuesta 3D (Fig. 2a-f).

(Rs-1) entre picos (MET y LIN): la Fig. 2a muestra una disminución en el valor (Rs-1) observada al disminuir el % de MeO. Los valores (Rs-1) entre (2,2–3) se lograron utilizando un % de MeOH no inferior al 74 % con un efecto mínimo del pH.

(Rs-3) entre picos (PIO y GLM): la figura 2b muestra una disminución en los valores de (Rs-3) al aumentar el pH y el % de MeOH. Los valores de (Rs-3) entre (2,2–3,5) se lograron utilizando %MeOH entre (74–77) % y pH entre (3–4).

Factor de capacidad-1 (K′-1): la figura 2c muestra que no se obtuvieron valores más bajos (K′-1) mediante variaciones en% de MeOH y pH. Sin embargo, el valor (K′-1) se vio significativamente afectado por el caudal adoptado en el análisis.

Factor de capacidad-4 (K′-4): la figura 2d muestra una disminución en los valores de (K′-4) al aumentar el% de MeOH y, en ligera medida, a valores de pH más altos. Se obtuvieron valores mínimos (K′-4) utilizando un % de MeOH cercano al 78 % con un ligero efecto cuando se utilizó un pH entre 3 y 5.

NTP (MET) y (GLM): la Fig. 2e, f muestra que se lograron NTP más altos de MET y GLM al usar valores de pH más cercanos a 3 con un efecto mínimo de% de MeOH.

Superficies de respuesta Diseño Box-Behnken (BBD) para interacción de factores.

El aumento del GLM (NTP) y la selección de la longitud de onda de detección adecuada fueron medidas exitosas que llevaron a aumentar la sensibilidad del método al GLM con un pico de GLM más simétrico y nítido. El pH del tampón tiene un efecto cuadrático sobre los NTP de MET y GLM, y este efecto no se puede determinar con otros métodos de un factor a la vez (OFAT). A partir de los resultados del diseño, se seleccionó en (3.7) el mejor pH del tampón que maximiza los NTP y proporciona valores de Rs y factor de capacidad razonables. Este valor de pH provocó un cambio en la ionización de ambos fármacos y maximizó los NTP en función de los valores de pKa de MET y GLM, que son 11,5 y 6,2, respectivamente.

Para resumir los resultados del proceso de optimización, el factor más significativo fue el % MeOH (A), ya que estaba afectando casi todas las respuestas; en la mayoría de los casos, fue necesario aumentar el % de MeOH. El caudal (B) afecta fuertemente a los factores de capacidad (MET-K′-1) y (GLM-K′-4). El uso de un caudal (1,2 ml/min) condujo al K′ mínimo para MET y GLM. El pH del tampón (C) afectó fuertemente a los NTP (MET y GLM) y al Rs-3 entre PIO y GLM.

Los criterios de optimización ayudarían a seleccionar los niveles óptimos de diferentes CMP. Para optimizar los diferentes CQA para lograr una eficiencia y un rendimiento óptimos del método para el análisis de los tres fármacos, se describieron los siguientes criterios:

Minimizar Rs-1 y R-3 en el rango (2,2–3) y (2,2–3,5), respectivamente.

Minimizar K′-1 y K′-4 para una elución rápida y un tiempo de ejecución mínimo.

Maximizar los NTP tanto para MET como para GLM.

Gráficos de deseabilidad La Fig. S5a-c muestra que para lograr la máxima deseabilidad, el% de MeOH debe ser tan alto como (76–78) % y el pH debe estar entre (3,5–4), así como el caudal debe estar al máximo. (1,2 ml/min).

La región de diseño se generó aplicando limitaciones (máx. y mínima) que se lograron (Rs-1) por debajo de 3,6, (Rs-3) por debajo de 4,5, (K′-1) por debajo de 1,98, (K′-4) por debajo de 5,5, NTP MET por debajo de 3000 y NTP GLM por debajo de 5500 con una proporción de resultados que alcanza el (TI) de 0,9 (unilateral) como se muestra en la Tabla S2.

Las regiones de diseño operables con el método (gráficos superpuestos) ilustradas en las figuras S5d – f mostraron que las mejores y óptimas condiciones se pueden obtener utilizando una relación de MeOH más alta (76–78), el pH debe estar entre (3,6–5) y el caudal debe estar entre (1,05-1,2) ml/min.

Utilizando el algoritmo de deseabilidad de Derringer, resultaron 30 soluciones para los criterios seleccionados; Se propuso que los parámetros cromatográficos óptimos fueran %MeOH(A) (78%) como se muestra en la Fig. 3a, caudal (B) (1,2 ml/min) como se muestra en la Fig. 3b y pH del tampón (3,73) como se muestra en Fig. 3c con valores de atributo esperados de Rs-1 (2.22) como se muestra en la Fig. 3d, Rs-3 (3.14) como se muestra en la Fig. 3e, K′-1 (1.48) como se muestra en la Fig. 3f, K′ -4 (3,78) como se muestra en la Fig. 3g, NTP (MET) (2518) como se muestra en la Fig. 3h y NTP (GLM): (4389) como se muestra en la Fig. 3i con un valor de deseabilidad de (0,552). Las gráficas de deseabilidad se muestran en la figura S5d-f.

Rampas de solución para condiciones óptimas (a – i).

Estas condiciones cromatográficas óptimas sugeridas se verificaron y probaron tres veces, y la media de los valores observados fue Rs-1 (2,28), Rs-3 (3,42), K′-1 (1,49), K′-4 (4,08), NTP. (MET) (2568) y NTP (GLM): (4520). Los valores predichos se compararon con los observados para demostrar la previsibilidad del modelo. Todos los resultados fueron satisfactorios, con bajos errores de predicción.

Finalmente, 78:22 % de MeOH: tampón fosfato 0,05 M que contenía (0,05 % v/v de trietilamina) pH (3,73) fue la fase móvil óptima. La temperatura de la columna de 25 °C, el caudal de 1,2 ml/min y el detector PDA se configuraron a 227 nm para permitir la detección de los tres fármacos considerados.

La técnica AQbD propuesta fue validada con respecto a las directrices de la ICH49. Los resultados de los valores de los parámetros de idoneidad del sistema en condiciones óptimas de separación se presentan en la Tabla S3.

La técnica establecida de RP-HPLC se utilizó en los rangos de 0,05 a 30 µg/ml para PIO, de 0,05 a 500 µg/ml para MET y de 0,04 a 20 µg/ml para GLM, como se presenta en la Tabla 3.

El límite de detección y el límite de cuantificación (LOD y LOQ) se determinaron haciendo referencia a las Ecs. (2) y (3); respectivamente, la Tabla 3 muestra LOD y LOQ.

donde b es la pendiente de la curva de calibración y Sa es la desviación estándar de la intersección y de las líneas de regresión.

La precisión del enfoque propuesto se determinó calculando el porcentaje medio de recuperaciones en tres niveles de concentración diferentes (determinación por triplicado) para MET (500, 400 y 250) µg/mL, PIO (15, 12 y 7,5) µg/mL, y GLM (2, 1,6 y 1) µg/mL (Tabla S4).

La precisión intradía se evaluó mediante tres análisis repetidos en tres niveles de concentración de fármaco el mismo día. La (SD) y (% RSD) se calcularon para los resultados del análisis como se presenta en la (Tabla S5).

Los mismos tres niveles de concentración de cada fármaco se analizaron en tres réplicas en tres días sucesivos diferentes. La (SD) y (% RSD) se calcularon para los resultados del análisis como se presenta en la (Tabla S5).

Todos los resultados fueron inferiores a 2, como se presenta en la (Tabla S5), lo que demuestra que la técnica fue precisa.

Según las directrices de la ICH49, la solidez de un proceso analítico es la capacidad del rendimiento del método para no verse afectado por cambios pequeños pero deliberados. Definir MODR basándose en el enfoque AQbD ayuda a evaluar la solidez y solidez del método analítico antes de la validación, ya que el MODR en sí es la región en la que los CMP cumplen con los CQA.

Los estudios de robustez del RP-HPLC establecido utilizando la técnica AQbD se llevaron a cabo utilizando el enfoque basado en diseño multivariado para estudiar el efecto de la variación simultánea de los cinco factores estudiados (pH,% de metanol, caudal, temperatura y concentración del tampón). sobre las respuestas seleccionadas. Se utilizó un diseño de selección factorial regular de dos niveles (− 1, + 1) de ocho ejecuciones con cinco factores para las pruebas de robustez (Tabla S6) para estudiar solo los efectos principales de los parámetros de estudio propuestos (donde las interacciones de los factores no son comunes y para reducir el tiempo de experimentación) sobre el rendimiento del método HPLC.

Se realizaron pequeños cambios en los factores estudiados. La inspección de los gráficos de Pareto reveló que el efecto de todos los parámetros considerados (CMP) no fue significativo en las respuestas preseleccionadas (CQA). Esto se confirmó porque todos los valores t experimentales fueron inferiores al límite de valores t críticos como como se muestra en la Fig. S6a – g. Los resultados indican una buena estabilidad y rendimiento cromatográfico del enfoque establecido ante pequeños cambios deliberados en sus (CMP).

La especificidad del enfoque establecido se demostró comparando los resultados de las pruebas y los cromatogramas de una solución de tableta simulada que contiene todos los excipientes que se espera que estén presentes en la forma farmacéutica y la solución que contiene matrices biológicas de plasma con la de una solución estándar de medicamentos puros de las mismas concentraciones. en las condiciones óptimas de separación como se presenta en (Fig. 4a, b).

Cromatogramas para medicamentos puros estándar (a), mezcla preparada en laboratorio (b) y plasma enriquecido (c).

Para la estimación del verdor de una técnica analítica se aplicó el enfoque analítico de escala ecológica50. La suma de los puntos totales de penalización se calculó para todo el procedimiento. Según los resultados calculados, el enfoque validado tiene un verdor aceptable con una puntuación analítica en la escala ecológica de 73 (Tabla S7).

El enfoque validado se aplicó para determinar simultáneamente tres niveles de concentración diferentes de los tres fármacos antidiabéticos en sus tabletas preparadas en laboratorio en una proporción (500:15:2) (MET:LIN:EMP). Se calcularon el % de recuperación, la DE y el % de RSD y se obtuvieron resultados aceptables (Tabla 4). Los resultados del enfoque validado para las tres concentraciones de las tabletas preparadas simuladas se compararon con los encontrados aplicando la técnica RP-HPLC publicada utilizando una prueba t y una prueba F con un nivel de confianza del 95% con respecto a la exactitud y precisión, respectivamente. Los valores calculados no excedieron los tabulados, lo que demuestra alguna diferencia significativa entre los métodos informados y propuestos, como se presenta en la (Tabla 4).

Se aplicó el método validado para la determinación simultánea de (MET y GLM) en tabletas Amaryl M 2/500 (2 mg Glimepirida y 500 mg Metformina) con Número de Lote: 2/2024, (PIO y MET) en tabletas Bioglita Plus (15 /500) con Número de lote: 200061 y (PIO y GLM) en tabletas de Piompride 30/4, Número de lote: 191294, AVERROES PHARMA-Egipto (30 mg de pioglitazona y 4 mg de glimepirida). Se calcularon el porcentaje de recuperación, la DE y el % de RSD y se obtuvieron resultados aceptables (Tabla S8).

El método validado se aplicó para la cuantificación simultánea de (MET, PIO y GLM) con un estándar interno de LIN de 0,1 µg/ml en muestras de plasma enriquecidas, como se presenta en (Fig. 4c). Se trazaron curvas de calibración que cubren el rango de 0,05 a 2 µg. /mL de MET y PIO y 0,04–2 µg/mL de GLM. Los resultados se presentan en la Tabla 5.

Este estudio describe un método RP-HPLC rápido, sensible y ecológico que se optimizó y validó mediante el uso del paradigma AQbD para la identificación y estimación de MET, PIO y GLM simultáneamente en su tableta pura y preparada en laboratorio. El método se amplió para determinar los fármacos estudiados en muestras de plasma enriquecidas. Se siguió un enfoque científicamente organizado para desarrollar, optimizar e incluso validar el método propuesto, donde se evaluó MODR para minimizar el número de resultados fuera de tendencia mediante la determinación de la región de diseño donde se cumplían todos los criterios cromatográficos establecidos. Debido al alto nivel de calidad incorporado en este método RP-HPLC, es un excelente candidato para análisis de rutina en laboratorios de control de calidad y análisis bioanalíticos. Además, los procedimientos y detalles mencionados en este artículo pueden ayudar a los experimentadores pares a construir e interpretar métodos construidos por AQbD de manera eficiente.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo.

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Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Autoridad de Financiamiento de Ciencia, Tecnología e Innovación (STDF) en cooperación con el Banco Egipcio de Conocimiento (EKB). Esta investigación no recibió ninguna subvención específica de agencias de financiación del sector público o comercial.

Departamento de Química Analítica Farmacéutica, Facultad de Farmacia, Universidad de Tanta, Tanta, 31527, Egipto

Aya A. Marie, Sherin F. Hammad y Amira H. Kamal

Departamento de Química Farmacéutica, Facultad de Farmacia, Universidad Horus-Egipto, Nueva Damietta, 34517, Egipto

Aya A. Marie, Mohamed M. Salim y Mahmoud M. Elkhodary

Departamento de Química Analítica Farmacéutica, Facultad de Farmacia, Universidad de Mansoura, Mansoura, 35516, Egipto

Mohamed M. Salim

Facultad de Farmacia, Campus Médico de la Universidad de Tanta, Elgeish Street, Tanta, 31111, Egipto

Amira Kamal

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AAM: visualización, investigación, software, validación, recopilación de datos, redacción: borrador original. MMS: conceptualización, supervisión, investigación, metodología y validación. SFH: conceptualización, supervisión, investigación, metodología, validación, redacción—revisión y edición. MME: metodología, visualización, investigación, software, validación. AHK: metodología, visualización, investigación, validación, redacción: revisión y edición.

Correspondencia a Amira H. Kamal.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Marie, AA, Hammad, SF, Salim, MM et al. Deducción del espacio de diseño operable de la técnica RP-HPLC para la estimación simultánea de metformina, pioglitazona y glimepirida. Informe científico 13, 4334 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30051-x

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Recibido: 21 de agosto de 2022

Aceptado: 15 de febrero de 2023

Publicado: 16 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30051-x

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