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Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 6394 (2023) Citar este artículo

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Con más de 20 medicamentos modificados con polietilenglicol (PEG) aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) en el mercado, el PEG es el polímero estándar de oro en bioconjugación. El acoplamiento mejora la estabilidad, la eficiencia y puede prolongar el tiempo de circulación sanguínea de las proteínas terapéuticas. Aunque la PEGilación se describe como no tóxica y no inmunogénica, se acumulan informes con datos que muestran reacciones alérgicas al PEG. Dado que el PEG no sólo se utiliza con fines terapéuticos, sino que también se puede encontrar en alimentos y cosméticos, los anticuerpos anti-PEG pueden aparecer incluso sin tratamiento médico. La hipersensibilidad al PEG puede provocar una reducción de la eficacia del fármaco, una rápida eliminación de la sangre y, en casos raros, reacciones anafilácticas. Por tanto, es fundamental encontrar alternativas al PEG. En este estudio, presentamos poliglicerol lineal (GLP) para bioconjugación como un polímero alternativo al PEG. Informamos la conjugación de LPG y PEG mediante química de clic a la glicoproteína eritropoyetina (EPO), sintetizada en un sistema de síntesis de proteínas libre de células eucariotas. Además, se evaluó la influencia de los polímeros en la estabilidad y actividad de la EPO en una línea celular dependiente de la hormona del crecimiento. Las características similares de ambos bioconjugados muestran que la LPGilación puede ser una alternativa prometedora a la PEGilación.

La EPO se conoce como la hormona que regula la producción de nuevos glóbulos rojos. La mayoría de las publicaciones recientes abordan nuevos hallazgos sobre el mecanismo de acción de la EPO sobre la eritrocitosis1, el ictus isquémico2, la anemia3, la hipoxia4, la angiogénesis tumoral5 y las enfermedades neurodegenerativas6. Llaman especialmente la atención las variantes de EPO genéticamente modificadas. Los agentes estimulantes de la eritropoyetina (AEE) se mejoraron continuamente, comenzando con la eritropoyetina alfa y beta hasta variantes con vidas medias más largas, como la darbepoetina alfa7 y la EPO pegilada (PEG-EPO8). Se sabe que PEG-EPO estimula la eritropoyesis de forma más eficaz con un intervalo de dosificación prolongado9. La EPO pegilada (Mircera®) obtuvo la aprobación de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) en 2007 y se prescribe contra la anemia asociada con enfermedades renales10,11. Teniendo en cuenta el éxito de la EPO pegilada y otros productos biofarmacéuticos, se espera que el mercado mundial de medicamentos pegilados alcance los 10,5 mil millones de dólares estadounidenses en 202412. Sin embargo, surge un problema esencial con los biofarmacéuticos pegilados: los anticuerpos dirigidos contra el PEG. El PEG se considera un polímero biocompatible no tóxico y no inmunogénico que se adhiere a más de 20 medicamentos basados en proteínas aprobados por la FDA13. Además, las terapias no proteicas, como las vacunas de ARNm, contienen nanopartículas PEGiladas14. Las proteínas, enzimas, péptidos y nanopartículas modificadas con PEG se caracterizan por una mayor solubilidad en agua y estabilidad proteolítica, lo que da como resultado una vida media prolongada15. Aunque se han logrado avances significativos, los sistemas pegilados todavía tienen ciertas limitaciones que pueden restringir su uso generalizado. Estas limitaciones incluyen el desarrollo de anticuerpos anti-PEG tras el uso repetido de sustancias PEGiladas, lo que reduce su eficacia terapéutica y, en casos específicos, reacciones alérgicas graves como la anafilaxia16. Un estudio de Yang et al. identificaron anticuerpos anti-PEG en el 72% de las muestras contemporáneas mediante el uso de un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas cuantitativo y competitivo17. Curiosamente, reconocieron que el 50% de las muestras de suero de los años 1970 a 1990 en realidad también poseían anticuerpos anti-PEG. Gracias a ensayos novedosos y más sensibles, la detección de anticuerpos anti-PEG y reacciones inmunogénicas asociadas se producen con mayor frecuencia. Además, el uso de productos diarios como cosméticos, jabones y medicamentos que también contienen PEG también podría afectar la presencia de anticuerpos anti-PEG preexistentes18,19. Por lo tanto, es esencial repensar el manejo de los fármacos PEGilados, empezando por una detección fiable de anticuerpos anti-PEG y una adaptación precisa de las terapias con moléculas PEGiladas. Además, se han estudiado muchos polímeros naturales y sintéticos para sustituir al PEG y prolongar su vida media20,21,22,23. En este contexto, el poliglicerol lineal (GLP) representa un candidato prometedor debido a su estructura y características similares a las del PEG24. Tanto el GLP como el PEG poseen una cadena principal de poliéter, aunque el GLP lleva un grupo hidroxilo en cada unidad repetitiva, lo que permite la introducción de restos de inmovilización, direccionamiento y etiquetado25,26. El GLP es altamente biocompatible y los ésteres de oligogliceroles con hasta 10 unidades repetitivas han sido aprobados por la FDA como aditivos farmacéuticos y alimentarios y han estado disponibles comercialmente durante algunas décadas27,28. Recientemente, el GLP se ha conjugado con éxito con varias proteínas modelo mediante diferentes químicas de conjugación, incluida la conjugación aleatoria con albúmina sérica bovina29, la conjugación de sitio específico mediante cicloadición de azida-alquino catalizada por cobre (I) (CuAAC) con exenatida, la conjugación N-terminal con interleucina30. y Anakinra31 y conjugación específica de sitio mediante cicloadición de azida-alquino promovida por cepa (SPAAC) a interferón-α-2a32,33.

Aunque el acoplamiento de PEG con diferentes pesos moleculares a EPO se ha evaluado intensamente en las últimas dos décadas, sólo hay unos pocos informes que demuestran el uso de polímeros alternativos. Además, la cadena peptídica a menudo se modificaba dando como resultado una eliminación de los sitios de glicosilación y la química de conjugación se limitaba al N- o C-terminal34. Por ejemplo, se acopló un péptido mimético de eritropoyetina a un hidroxietilalmidón biodegradable, mejorando el efecto biológico35. A menudo, estos acoplamientos se basan en procesos químicos en condiciones duras. En nuestro estudio, presentamos por primera vez una comparación de diferentes polímeros que se acoplaron mediante una reacción de clic biortogonal en condiciones suaves a una EPO con los tres sitios de N-glicosilación intactos. Además, utilizando la síntesis de proteínas libres de células se sintetizaron diferentes conjugados de EPO en muy poco tiempo, lo que permitió el análisis de varias construcciones en paralelo. Por lo tanto, sintetizamos EPO PEGilada y LPGilada de sitio específico e investigamos su influencia en la actividad de la EPO en la línea celular TF-1 dependiente de la hormona del crecimiento. Hemos elegido la línea celular TF-1 debido a la presencia de un receptor hEPO endógeno. Se sabe que esta línea celular prolifera en presencia de un factor de crecimiento hematopoyético activo, como el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), diferentes interleucinas y EPO. Comparamos estos bioconjugados de GLP y PEG con Mircera® comercializado y analizamos la estabilidad de la EPO individual en suero humano. Para ello, se sintetizó EPO en un sistema libre de células como se informó anteriormente36. Los lisados traduccionalmente activos contienen vesículas de membrana endógenas derivadas del RE, llamadas microsomas, que permiten una translocación a la luz y la posterior modificación postraduccional, como la glicosilación y los puentes disulfuro37, ambos requisitos previos indispensables para la actividad de la EPO. Dado que en sistemas libres de células no es posible la O-glicosilación, se eligió esta posición para el acoplamiento de los polímeros de PEG y GLP. Por lo tanto, se introdujo un codón de parada de color ámbar en la secuencia del gen. La adición de un ARNt supresor apropiado y una aminoacil-ARNt sintetasa diseñada a la reacción libre de células condujo a la incorporación de una p-azido-l-fenilalanina (AzF) en la cadena polipeptídica naciente36. El grupo azido se utilizó además para hacer clic en PEG y GLP modificados con ciclooctina a través de SPAAC, lo que resultó en EPO modificada de sitio específico. Nuestro estudio muestra que los conjugados de EPO LPgilada muestran una actividad comparable a sus homólogos PEGilados en cultivo celular y se mantuvieron estables durante más de 24 h.

Los disolventes anhidros (dimetilformamida y tolueno) y los tubos de diálisis de celulosa benzoilada (2 kDa, 32 mm de ancho) se adquirieron en Merck (Darmstadt, Alemania). El bromuro de tetra-n-octilamonio al 98% se adquirió de ACROS Organics y se utilizó tal como se recibió. Todos los demás productos químicos se compraron a Merck (Darmstadt, Alemania), a menos que se indique lo contrario. Se usó α-metoxi-ω-amino-poli (etilenglicol) (PEG-NH2) de 10 kDa (Rapp POLYMERE, Tübingen, Alemania) tal como se recibió. Los espectros de 1H NMR se registraron en un Bruker AMX 500 (Bruker Corporation) o JEOL ECP 500 (JEOL GmbH). Los cambios químicos (δ) se informan en ppm a través del pico de disolvente deuterado como estándar. Las mediciones de IR se realizaron en un Nicolet AVATAR 320 FT_IR 5 SXC (Thermo Fisher Scientific) con un rango de detector de 4000–650/cm. Las mediciones de cromatografía de permeación en gel (GPC) en agua se realizaron con un Agilent 1100 equipado con un inyector automático, isopump y un refractómetro diferencial Agilent 1100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.). La columna PSS Suprema (precolumna), 1 × con un tamaño de poro de 30 Å, 2 × con un tamaño de poro de 1000 Å (todas ellas con un tamaño de partícula de 10 μm), se calibró con estándares Pullulan antes de las mediciones. Las mediciones de GPC en tetrahidrofurano (THF) se realizaron con un equipo Agilent SECurity (Serie 1200), equipado con un inyector automático, isopump y detector de UV y RI. La separación se realizó mediante un gel de fotoluminiscencia de Agilent (1 x precolumna, 3 x Mixed-C con un tamaño de partícula de 5 μm), que se calibró frente a estándares de poliestireno.

La protección acetálica del glicidol, su polimerización y modificación del extremo de la cadena se realizó con base en nuestros procedimientos previamente informados32. En resumen, en un matraz Schlenck secado a la llama (Oct) se secó 4NBr (268 mg, 0,480 mmol, 0,008 eq) en una atmósfera de argón. Después, se disolvió en 60 ml de tolueno seco a temperatura ambiente antes de añadir éter etoxietil glicidílico (EEGE) (10 ml, 65,6 mmol, 1 eq). La mezcla se enfrió en un baño de hielo y se añadió i-Bu3Al (2,1 ml, 2,4 mmol, 0,036 eq) rápidamente con agitación a alta velocidad. La reacción se dejó transcurrir durante la noche a temperatura ambiente y se inactivó mediante la adición de 1 ml de etanol. El producto bruto se purificó mediante diálisis frente a acetona (MWCO: 2000 g/mol). El producto se obtuvo como un aceite de color amarillo claro (GPC en THF: Mn: 20687, D: 1,12). Para la eliminación de grupos acetal, el polímero se disolvió en etanol (0,1 g/ml) y HCl (etanol al 3 % v/v) durante al menos dos horas antes de la diálisis en agua (MWCO: 1000 g/mol). El producto se obtuvo como un aceite incoloro (agua GPC: Mn: 11885, D: 1,19). Posteriormente, se disolvió el polímero desprotegido (1 g, 0,08 mmol, 1 eq) en 5 ml de DMF seca y se calentó a 80 °C a reflujo antes de agregar NaN3 (30 mg, 0,4 mmol, 5 eq) a la mezcla. La reacción transcurrió a esta temperatura durante 3 días y se purificó mediante diálisis en agua (MWCO: 1000 g/mol). La modificación exitosa se observó mediante espectroscopia IR (2100/cm de pico de azida). El grupo azida se redujo a amina disolviendo LPG-N3 (1 eq) en agua (0,05 g/ml). Posteriormente, se añadió a la solución TCEP (1,5 equivalentes a grupos N3). La reacción se siguió mediante espectroscopia IR hasta que desapareció la banda respectiva de N3. Después de eso, la purificación se realizó mediante diálisis en agua (MWCO: 1000 g/mol). Luego se disolvió LPG-NH2 (1 eq) en DMF seca (32 mg/ml), luego se añadieron a la mezcla Et3N (3 eq) y BCN-NHS (1,5 eq). La reacción se agitó durante la noche y se purificó mediante diálisis frente a agua (MWCO: 1000 g/mol). Como el BCN modificado con GLP es propenso a reticularse en estado seco, se supone la conversión total en esta etapa. La calidad de LPG-BCN se controló mediante el espectro 1HNMR (Figura 1 complementaria). Según la medición GPC en agua, el GLP tiene un MW de 11,8 kDa.

La modificación del PEG-NH2 comercial se realizó como el procedimiento descrito anteriormente para LPG-NH2. La calidad de PEG-BCN se controló mediante el espectro de 1HNMR (Figura complementaria 2). Según la medición de GPC en agua, el PEG tiene un PM de 10 kDa.

La secuencia del gen que codifica la secuencia de eritropoyetina (Uniprot P01588) se modificó para la síntesis de proteínas libres de células y la supresión del ámbar. Por lo tanto, se cambió la plantilla de ADN como se informó anteriormente38. Además, la secuencia señal nativa fue reemplazada por una secuencia señal de melitina (aaattcttagtcaacgttgcccttgtttttatggtcgtatacatttcttacatctatgcggac). Se diseñó una segunda construcción intercambiando el codón 153 (sitio de O-glicosilación) por un codón de parada de color ámbar. Las secuencias se fabricaron mediante síntesis de novo (Biocat GmbH, Alemania) y se ligaron en la estructura principal del vector pUC57-1,8 k.

La aminoacil-ARNt sintetasa diseñada (eAzFRS) y el ARNt supresor se fabricaron como se describe en detalle en Zemella et al. 201939. Brevemente, la aminoacil-ARNt sintetasa se sintetizó en el “RTS500 ProteoMaster E. coli HY Kit” (Biotechrabbit GmbH, Alemania), se purificó mediante Strep-Tag, se concentró y se almacenó a -80 °C en un tampón de almacenamiento de sintetasa (50 HEPES mM, KOAc 10 mM, MgCl2 1 mM, DTT 4 mM, NaN3 0,02%, pH 7,6).

El ADN molde para el ARNt supresor se generó mediante una reacción de PCR con un par de cebadores O-metilo específicos, seguido de una transcripción completa. El ARNt se purificó mediante extracción con fenol-cloroformo utilizando reactivo TRIzol (ThermoFisher Scientific), se precipitó con isopropanol y se resuspendió en agua ultrapura. El ARNt se dobló en un ciclador de PCR (Biometra TRIO, Analytik Jena) y se almacenó a -80 °C.

La síntesis de proteínas libres de células se basó en lisados traduccionalmente activos derivados de células cultivadas de Spodoptera frugiperda 21 (Sf21). La preparación del lisado se realizó como se describió anteriormente40,41. Se añadió plantilla de ADN (60 ng/μl) a una mezcla de reacción compuesta por 20 % (v/v) de lisado, aminoácidos 100 μM, sales, componentes energéticos y PolyG (10 μM, biomeros, Alemania). Un protocolo detallado de la reacción se describe en 38,42. Para controlar el rendimiento de proteínas mediante recuento de centelleo y la integridad de las proteínas mediante SDS-PAGE seguido de autorradiografía, se complementó la reacción con leucina 14C marcada radiactivamente de manera uniforme (fc 30 µM, Perkin Elmer, Alemania). La 14C-leucina se incorpora estadísticamente a la proteína sintetizada de novo. Para la incorporación del aminoácido no canónico se añadieron p-azido-1-fenilalanina 2 mM, eAzFRS 3 µM y ARNt supresor 5 µM. La integración exitosa fue monitoreada mediante autorradiografía. En detalle, se realizó una reacción de transcripción-traducción acoplada utilizando el plásmido que contiene un codón de parada ámbar en presencia y ausencia de sintetasa ortogonal eAzFRS. La reacción de síntesis en ausencia de eAzFRS da como resultado un patrón de bandas que corresponde a la EPO truncada en el aminoácido 153. Esta EPO truncada todavía posee las tres N-glicosilaciones. La reacción de síntesis en presencia de eAzFRS da como resultado un patrón de bandas que corresponde a la EPO de longitud completa con tres N-glicosilaciones. Una diferencia en el patrón de bandas, en particular un cambio en el peso molecular aparente de EPO en presencia de la sintetasa, verifica la incorporación de AzF. Además, la incorporación de AzF se demostró previamente mediante el acoplamiento específico de un colorante de fosfina reactivo con azida a EPO36.

Las reacciones se incubaron durante 3 h a 27 °C, 500 rpm, cubiertas con papel de aluminio.

Dado que la EPO se transloca a la luz de las vesículas microsomales, fue necesario liberar la proteína. Por lo tanto, los microsomas se centrifugaron a 16.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C y el sedimento se resuspendió en PBS con el detergente n-Dodecil-β-Maltósido (0,2% DDM, Sigma-Aldrich, St. Louis MO, EE. UU.) , se agitó durante 45 min a 1000 rpm y se centrifugó nuevamente. El sobrenadante se transfirió a un tubo Eppendorf vacío y se usó para el acoplamiento de polímeros de PEG y GLP y para análisis de estabilidad, así como ensayos de cultivo celular.

Los polímeros se disolvieron en agua hasta una concentración madre de 5 a 10 mM. Se incubaron 10 ng de EPO producida sin células con BCN-PEG y BCN-LPG 5 mM en un tubo Eppendorf durante la noche a 4 °C. El acoplamiento de los polímeros se controló mediante un desplazamiento de EPO en autorradiografía.

Las N-glicosilaciones de EPO modificada y no modificada se escindieron mediante PNGasa F (NEB, EE. UU.). El ensayo se realizó según el protocolo del fabricante.

El rendimiento proteico de la EPO sintetizada sin células se determinó mediante precipitación con ácido tricloroacético caliente (TCA, Carl Roth GmbH, Alemania) seguida de un recuento de centelleo líquido43.

Las muestras de EPO se precipitaron en acetona fría, se secaron y se resolubilizaron en tampón de muestra LDS (tampón de muestra NuPAGE LDS, Thermo Fisher Scientific). Las muestras se cargaron en geles SDS-PAGE prefabricados (NuPAGE, 10% Bis-Tris, Thermo Fisher Scientific) y se separaron durante 40 minutos a 180 V. Los geles se lavaron con agua, se tiñeron con un tinte seguro simplemente azul (Thermo Fisher Scientific) y se lavaron. de nuevo. Posteriormente, los geles se secaron durante 60 minutos a 70 °C (Unigeldyer 3545D, Alemania). Los geles se expusieron a pantallas de fósforo durante 48 h. Las bandas se visualizaron mediante imágenes de fósforo (Amersham Typhoon RGB, GE Healthcare).

Se cultivaron células TF-1 (Leibnitz-Institut DSMZ, Alemania, DSMZ-No. ACC-334) que expresaban el receptor hEPO en RPMI-1640 al 85 % (PAN Biotech), FCS al 13 % (Biochrom), piruvato de sodio al 1 % (Biowest ), penicilina-estreptomicina al 1% (PAN Biotech) y GM-CSF a 5 ng/ml (PeproTech, Alemania). Las células se incubaron a 37 °C y 5% de CO2 en matraces T25 y T75 en una incubadora de CO2 (Binder, Alemania). La densidad celular se mantuvo entre 2 y 7 × 105 células/ml. Para el ensayo de actividad, se transfirieron 2,0 x 105 células a medio nuevo sin GM-CSF. A cada variante de EPO (EPO recombinante, sintetizada sin células (Sigma-Aldrich, St. Louis MO, EE. UU., n.º E5546-50 UG), Mircera® (Roche, Basilea, Suiza, 0,3 ml)) y GM-CSF se les añadió una concentración final de 10 ng/mL. Se añadió un volumen igual de control sin plantilla (NTC) como control negativo. El crecimiento celular se controló durante una semana mediante tinción con azul tripán en una cámara de recuento Luna (Logos biosystems). El ensayo se realizó por triplicado y para cada muestra, se realizaron dos mediciones, lo que dio como resultado seis alícuotas contadas para cada muestra.

Se sintetizó EPO como se describió anteriormente y se acopló a PEG y GLP. Se incubó EPO modificada y no modificada con suero humano (SeraCon II, HiSS Diagnostics, Alemania) durante hasta 24 h. Después de 0, 2, 4, 8 y 24 h se tomó una alícuota y se congeló inmediatamente con nitrógeno líquido. Las alícuotas se precipitaron en acetona y se cargaron en un SDS-PAGE. La integridad de las bandas de proteínas se analizó mediante autorradiografía.

En la Fig. 1 se ve un esquema general de la síntesis y modificación del extremo de la cadena de LPG y PEG con el siguiente acoplamiento a EPO sintetizada sin células.

Esquema general de síntesis y modificación de extremos de cadena de LPG y PEG con el siguiente acoplamiento a EPO sintetizada sin células. Estructura EPO obtenida de la entrada 1BUY44 del PDB.

La síntesis de proteínas libres de células de EPO dio como resultado un patrón de bandas distinto con cuatro bandas definidas (Fig. 2A). Estas bandas corresponden a las tres N-glicosilaciones de la EPO (glicosilada en uno, dos o tres sitios) y a la forma no glicosilada de la EPO. La O-glicosilación adicional de la EPO no se aborda durante la síntesis de proteínas libres de células. Por lo tanto, el aminoácido no canónico se colocó en la posición de la O-glicosilación. La introducción del aminoácido no canónico p-azido-l-fenilalanina (AzF) en la posición de O-glicosilación no alteró el patrón de glicosilación de EPO (azido-EPO, carril 3). La glicodigestión con PNGasa F para ambas muestras dio como resultado una banda más baja en el peso molecular esperado de EPO no glicosilada (carriles 2 y 4). Sin la sintetasa ortogonal aplicada durante la síntesis libre de células, no se visualizó EPO de longitud completa en la autorradiografía (carril 5). Además, se detectó el producto de terminación glicosilado. Después de la incubación con PNGasa F, sólo se detectó el producto de terminación desglicosilado (carril 6).

Acoplamiento quimioselectivo de eritropoyetina con LPG-BCN y PEG-BCN. (A) Autorradiografía de diferentes variantes de EPO: carril 1 y 2 EPO de longitud completa sin aminoácidos no canónicos, carril 3 y 4 producto de supresión con p-azido-L-fenilalanina incorporada, carril 5 y 6 producto de terminación terminado en ámbar codón de parada. Cada variante se analizó en ausencia (carriles 1, 3, 5) y presencia (carriles 2, 4, 6) de glicosidasa PNGasa F. La incorporación exitosa de AzF condujo a un patrón de bandas comparable al observado para la EPO de longitud completa sin aminoácido canónico. La síntesis de EPO (con codón de parada ámbar) en ausencia de eAzFRS condujo a un patrón de bandas con un peso molecular reducido como se esperaba para el producto truncado. (B) Autorradiografía después del acoplamiento de LPG-BCN y PEG-BCN a EPO. Los carriles 1 a 4 y 9 muestran el acoplamiento de LPG-BCN a AzF que contiene EPO (carril 1 a 2), EPO terminada (carril 3 a 4) y EPO completa (carril 9) en ausencia (carril 1 y 3). y presencia (carriles 2, 4, 9) de PNGasa F. El acoplamiento exitoso de LPG-BCN a AzF que contiene EPO se observa mediante un cambio de las bandas correspondientes de EPO a un peso molecular más alto (carriles 1 y 2) alrededor de 50-60. kDa. Los carriles 5 a 8 y 10 muestran el acoplamiento de PEG-BCN a AzF que contiene EPO (carril 5 a 6), EPO terminada (carril 7 a 8) y EPO completa (carril 10) en ausencia (carril 5 y 7). y presencia (carriles 6, 8, 10) de PNGasa F. El acoplamiento exitoso de PEG-BCN a AzF que contiene EPO se observa mediante un cambio de las bandas correspondientes de EPO a un peso molecular más alto (carriles 5 y 6) alrededor de 40-48. kDa. Las imágenes de autorradiografía sin recortar se incluyen en Información complementaria.

Dado que la incorporación de AzF se verificó en un primer paso, se incubó azido-EPO con PEG y GLP modificados con BCN para obtener el bioconjugado específico del sitio (Fig. 2B). La incubación de azido-EPO con LPG-BCN dio como resultado un patrón de bandas más débil al peso molecular esperado para la EPO desacoplada. Se ven manchas y bandas adicionales de mayor peso molecular, lo que indica un acoplamiento exitoso del polímero (Fig. 2B, carril 1). Esta suposición se verifica mediante la incubación del LPG-BCN con la EPO truncada resultante de la terminación en el codón de parada ámbar. Aquí no se vieron bandas adicionales encima del producto de terminación para LPG-BCN (carril 3). La glicodigestión de LPG-EPO dio como resultado un cambio del frotis a un peso molecular más bajo, lo que indica que la EPO glicosilada se acopló con éxito a LPG-BCN (carril 2).

Se obtuvo un resultado similar para la incubación de azido-EPO con PEG-BCN. Aquí son visibles bandas definidas con un peso molecular más alto, lo que verifica el acoplamiento de PEG-BCN a azido-EPO (carril 5). Nuevamente, después de la digestión con PNGasa F, la banda prominente cambió a un peso molecular aparente más bajo, lo que indica que la azido-EPO glicosilada se acopló con éxito a PEG-BCN (carril 6). A diferencia de LPG-BCN, mediante autorradiografía se detecta un acoplamiento ligeramente inespecífico con el producto de terminación de PEG-BCN (carril 7). Esto es aún más visible mediante la incubación de EPO desglicosilada (sin grupo azido) con los polímeros (carriles 4 y 8). Aquí no se espera ningún acoplamiento ya que no hay AzF presente en la EPO traducida. Por lo tanto, en la autorradiografía debería verse un patrón de bandas comparable al de la figura 1, carril 5. De hecho, el mismo patrón de bandas es visible en presencia de GLP. Por el contrario, una ligera banda adicional en presencia de PEG es una indicación visible de una ligera unión inespecífica de PEG a EPO truncada. También se detectó un acoplamiento inespecífico comparable de PEG-BCN con EPO de longitud completa sin AzF incorporado (carril 10). No se observó ningún acoplamiento inespecífico de LPG-BCN con EPO de longitud completa sin AzF incorporado (carril 9). Los controles adicionales revelaron los resultados esperados (Figura complementaria 3) que confirman la integración de AzF y el posterior acoplamiento de cada polímero. Sin embargo, se obtuvo una mezcla de EPO acoplada a GLP y EPO no acoplada para el análisis de cultivos celulares. Según la autorradiografía, alrededor del 50 al 70 % de la muestra contiene EPO acoplada a GLP, mientras que el 30 al 50 % restante está compuesto de EPO desacoplada. Dado que el acoplamiento de PEG a EPO resultó en una eficiencia de casi el 100 %, estimamos que el porcentaje de EPO acoplado a PEG para ensayos de cultivo celular es de alrededor del 90 %. El 10% restante está compuesto por EPO desacoplada y PEG-EPO acoplada de forma inespecífica.

Para la determinación de la actividad de las variantes individuales de EPO, se cultivó una línea celular dependiente de la hormona del crecimiento (células TF-1) en presencia y ausencia de EPO modificada y no modificada (Figs. 3 y 4). El ensayo de actividad mostró que cada muestra que contenía EPO dio como resultado un crecimiento de células comparable a la EPO disponible comercialmente. El mayor efecto se observó después de la adición de PEG-EPO (Fig. 3). El efecto fue incluso mayor en comparación con la EPO no modificada y la EPO PEGilada disponible comercialmente (Mircera®). Como se esperaba, los controles (sin control de plantilla y producto de terminación) mostraron actividad nula o solo limitada (producto de terminación). Curiosamente, la EPO modificada con PEG y la EPO no modificada mostraron curvas de crecimiento casi comparables hasta el día 4. La curva de crecimiento de la EPO no modificada alcanzó su máximo después de 4 días, mientras que el pico de la EPO modificada con PEG se calculó después de 5 días. Además, las células incubadas con EPO modificada con PEG mostraron una curva de crecimiento prolongada.

Ensayo de actividad celular de EPO sintetizada libre de células modificada con PEG y no modificada. Curvas de crecimiento de la línea celular TF-1 suplementada con EPO modificada con PEG (línea continua), EPO no modificada (línea discontinua), producto de terminación (línea discontinua de un solo punto), control sin células sin plantilla (NTC, línea discontinua) línea de doble punto), EPO comercial (línea discontinua) y Mircera® comercial (línea discontinua gris). Las concentraciones de variantes de EPO sintetizadas sin células se determinaron mediante precipitación con TCA. Se agregaron 10 ng/ml de cada muestra a las células TF-1 cultivadas en una placa de 24 pocillos. Las células se contaron durante 6 días. Los datos se presentan como la desviación estándar de tres experimentos independientes medidos por duplicado (n = 3).

Ensayo de actividad celular de EPO sintetizada libre de células modificada con GLP y no modificada. Curvas de crecimiento de la línea celular TF-1 suplementada con EPO modificada con LPG (línea continua), EPO no modificada (línea discontinua), producto de terminación (línea discontinua de un solo punto), control libre de células sin plantilla (NTC, línea discontinua) línea de doble punto), EPO comercial (línea discontinua) y Mircera® comercial (línea discontinua gris). Las concentraciones de variantes de EPO sintetizadas sin células se determinaron mediante precipitación con TCA. Se agregaron 10 ng/ml de cada muestra a las células TF-1 cultivadas en una placa de 24 pocillos. Las células se contaron durante 6 días. Los datos se presentan como la desviación estándar de tres experimentos independientes medidos por duplicado (n = 3).

Se observó un efecto comparable después de la adición de LPG-EPO y los controles correspondientes (Fig. 4). La tasa de crecimiento más alta se determinó después de la adición de EPO comercial, lo que dio como resultado una densidad celular máxima de 7 × 105 células/ml. Nuevamente, el efecto de LPG-EPO con una densidad celular máxima de 6,2 × 105 células/mL fue comparable al de la EPO comercial. Sorprendentemente, el máximo de células contadas después de la adición de LPG-EPO coincidió con el de PEG-EPO en los días 4 y 5. El efecto de LPG-EPO fue incluso mayor en comparación con la adición de PEG-EPO. Nuevamente, la adición de EPO no modificada sintetizada sin células dio como resultado una densidad celular máxima en el día 4 con 5,5 × 105 células/ml.

Se detectaron los resultados esperados para los controles: las células mueren rápidamente en presencia de producto de terminación y NTC. Los controles adicionales no revelaron ningún efecto de los polímeros en el cultivo celular (Figura complementaria 4).

El efecto del LPG y PEG conjugados sobre la estabilidad de la EPO se analizó adicionalmente mediante una prueba de estabilidad en suero (Fig. 5). Se incubaron variantes de EPO modificada y no modificada durante 24 h en suero humano. Las muestras se recogieron en momentos predeterminados. La integridad de la proteína se analizó mediante autorradiografía. La EPO no modificada (de longitud completa y con aminoácidos no canónicos) mostró el patrón de bandas característico que consiste en EPO no glicosilada y EPO adicional que está glicosilada en hasta tres sitios. PEG-EPO mostró solo una banda con un peso molecular más alto que la EPO, correspondiente a la proteína acoplada al polímero. No se detectó ninguna proteína desacoplada. LPG-EPO mostró nuevamente una mancha por encima de la banda de PEG-EPO. Son visibles ligeras bandas de EPO desacoplada. La conjugación de PEG y GLP no mostró una influencia significativa en la estabilidad sérica de EPO, ya que todos los bioconjugados mostraron un patrón de bandas comparable incluso después de 24 h de incubación en suero humano.

Análisis de estabilidad de EPO modificada y no modificada. Se incubaron EPO de longitud completa no modificada, EPO no modificada que alberga un aminoácido no canónico (ncaa), EPO modificada con PEG y modificada con LPG hasta 24 h en suero humano. Posteriormente, las muestras se precipitaron con acetona y se analizaron mediante SDS-PAGE con la siguiente autorradiografía. No se observó ningún cambio en el patrón de bandas después de 24 h, lo que indica muestras de EPO estables. Las imágenes de autorradiografía sin recortar se incluyen en Información complementaria.

El polietilenglicol (PEG) ha sido el "estándar de oro" para mejorar las características de las proteínas, como la estabilidad, la solubilidad y la inmunogenicidad. Durante los últimos 30 años se fabricó una amplia gama de estructuras de PEG diferentes, desde pesos moleculares pequeños (550 Da) hasta polímeros lineales y ramificados de gran tamaño (> 8.000.000 Da)45. Mientras que en 1992 solo se detectaron siete estructuras diferentes de PEG en productos cosméticos46, este número aumentó a más de 340 estructuras diferentes de PEG en 201547. El uso frecuente de PEG también está relacionado con el comportamiento inerte y no inmunogénico del PEG. Sin embargo, informes recientes muestran que pueden aparecer anticuerpos anti-PEG después de la inyección de proteínas y liposomas PEGilados48,49 y después del contacto con productos cosméticos que contienen PEG. En particular, múltiples cadenas cortas de PEG (<10 kDa) unidas a proteínas tienen una mayor probabilidad de inducir anticuerpos anti-PEG50,51. Un estudio reciente ha analizado el impacto de los anticuerpos IgM e IgG anti-PEG preexistentes sobre la eficacia terapéutica de la EPO52 PEGilada. Para ello, se estableció un modelo de ratón con anticuerpos monoclonales anti-PEG preinyectados antes de la administración de PEG-EPO. Como resultado, la capacidad de PEG-EPO para inducir la producción de nuevos glóbulos rojos fue bloqueada por anticuerpos anti-PEG debido a la acumulación de PEG-EPO en el hígado y el bazo. La actividad biológica de PEG-EPO se recuperó aumentando la concentración inicial. Por lo tanto, la dosis adecuada de PEG-EPO debe evaluarse dependiendo de la medición de anticuerpos anti-PEG preexistentes en pacientes individuales. Alternativamente, biomoléculas novedosas que tengan una función similar a la del PEG podrían sortear los problemas actuales con los anticuerpos anti-PEG.

Mientras tanto, polímeros sintéticos alternativos como poli(gliceroles), poli(oxazolinas), poli(metacrilato de hidroxipropilo), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), poli(N-(2-hidroxipropil)metacrilamida), poli(vinilpirrolidona), poli(N ,N-dimetilacrilamida) y poli(N-acriloilmorfolina) se han estudiado para reemplazar el PEG53,54. Cada uno de los polímeros presenta ventajas únicas, como la no inmunogenicidad, la alta hidrofilicidad, la buena biocompatibilidad, pero también desventajas como la acumulación, la no biodegradabilidad y los costes de síntesis, parcialmente elevados55. Por lo tanto, los polímeros deben evaluarse en detalle para obtener información sobre las características de cada proteína y su posible impacto en el cuerpo humano.

Debido a las características estructurales del poliglicerol lineal (GLP), propone un candidato prometedor para la conjugación con proteínas. En un estudio que compara los liposomas PEG y LPGilados, Abu Lila et al. observaron que, a diferencia de los liposomas PEGilados, la modificación con GLP mejora el rendimiento in vivo del sistema. Los liposomas LPgilados no indujeron un aclaramiento sanguíneo acelerado (ABC), una limitación de los liposomas PEGilados tras la administración repetida, que puede influir negativamente en la actividad farmacéutica56.

Imran Ul-haq et al. compararon PEG y GLP en entornos in vitro e in vivo. Demostraron que el GLP tiene una viscosidad intrínseca 25 veces menor que la del PEG al comparar moléculas del mismo tamaño. Esta característica es de gran importancia en formulaciones donde se requieren concentraciones más altas. Además, los estudios basados en ensayos de hemólisis y agregación de glóbulos rojos (RBC) observaron que el GLP no inducía ninguna agregación de glóbulos rojos incluso en concentraciones de 10 mg/mL, mientras que el PEG inducía una agregación masiva de glóbulos rojos a esta concentración57. Esto también se ha observado antes para PEG y LPG58 de menor peso molecular.

Se eligió la síntesis de proteínas sin células para analizar las características fundamentales de los polímeros basados en PEG y GLP, como el impacto en la estabilidad e integridad de las proteínas, así como la influencia en las células humanas cultivadas. La síntesis y modificación exitosa de EPO en sistemas de síntesis de proteínas libres de células se demostró anteriormente36. A diferencia del estudio de 2018, ahora hemos analizado el efecto de los polímeros acoplados sobre las características de los EPO. Curiosamente, ambos polímeros mostraron comportamientos diferentes después del proceso de acoplamiento. Después de la conjugación de polímeros, se hizo visible en la SDS-PAGE un cambio prominente hacia un peso molecular más alto. De hecho, la migración del gel parecía diferente entre ambos polímeros a pesar de que LPG-BCN y PEG-BCN tienen un peso molecular similar de 10 kDa. Este efecto puede explicarse por interacciones específicas de los polímeros dentro de SDS-PAGE como se describió anteriormente para PEG59. Además, también se observó un efecto comparable después del acoplamiento de LPG-BCN y PEG-BCN a la interleucina-431 humana. Además de la migración del gel modificada, la bioconjugación de LPG y PEG mostró una eficiencia de acoplamiento diferente. Para PEG-BCN se estima una eficiencia de acoplamiento del 90-95% y para LPG-BCN una eficiencia de acoplamiento del 50%. Estas diferencias pueden ocurrir debido a perfiles específicos de interacción proteína-polímero. En el caso de PEG-BCN se describen lisinas y argininas con carga positiva, mientras que el GLP se encontró muy cerca de las serinas y metioninas32. La proporción de lisinas y argininas es mucho mayor en la EPO en comparación con las metioninas y serinas. Independientemente, la eficiencia de acoplamiento fue suficiente para ambos polímeros, lo que condujo a una señal específica determinada por autorradiografía. En consecuencia, se determinó el efecto de la EPO modificada y no modificada sobre el cultivo celular. Las curvas de crecimiento mostraron los resultados esperados ya que las células sólo crecieron en presencia de variantes de EPO. No obstante, las diferencias entre las variantes de EPO fueron visibles. Dentro de los primeros tres días, el crecimiento de las células tras la estimulación con PEG-EPO no modificado y LPG-EPO fue casi idéntico. Después del día 4, el crecimiento de las células incubadas con EPO no modificada se detuvo mientras que las células incubadas con ambas EPO modificadas siguieron creciendo. Esto indica una actividad prolongada de la EPO modificada con polímero. Estos hallazgos concuerdan con los efectos positivos descritos de las variantes de EPO conjugada con polímeros7,8.

Los datos obtenidos del ensayo de estabilidad también concuerdan con hallazgos anteriores. Un estudio anterior recopiló muestras de suero y plasma que contenían EPO y las almacenó durante 14 días en diferentes condiciones. Incluso la muestra almacenada a temperatura ambiente contenía EPO inmunorreactiva después de 14 días60.

Dado que la síntesis de proteínas libres de células se puede realizar en una escala de µL a litro y la síntesis de proteínas farmacéuticamente relevantes como la EPO generalmente se realiza en unas pocas horas, el sistema ofrece una excelente opción para la detección de alternativas de PEG acopladas en pre- Posiciones definidas en la EPO humana.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y sus archivos de información complementaria).

Polietilenglicol)

Poliglicerol lineal

eritropoyetina

Cicloadición de alquino-azida catalizada por cobre

Cicloadición de azida-alquino promovida por tensión

Biciclo[6.1.0]non-4-ino

Tirosil-ARNt-sintetasa de E. coli mejorada y modificada

P-azido-l-fenilalanina

Spodoptera frugiperda

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Por la preparación del lisado Sf21, los autores desean agradecer a D. Wenzel y Dipl. En g. (FH) DA Wüstenhagen (Fraunhofer IZI-BB, Potsdam-Golm, Alemania).

Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL. Esta investigación fue financiada por el Ministerio de Ciencia, Investigación y Cultura (MWFK, Brandeburgo, Alemania), el proyecto PZ-Syn (número de proyecto F241-03-FhG/005/001) y el Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF, Alemania), proyecto CEFOX (031B0831) y proyecto Next-PEG (13XP5049A).

Estos autores contribuyeron igualmente: Paria Pouyan, Anne Zemella, Rainer Haag y Stefan Kubick.

Instituto de Química y Bioquímica, Universidad Libre de Berlín, Takustr. 3, 14195, Berlín, Alemania

Paria Pouyan y Rainer Haag

Instituto Fraunhofer de Terapia Celular e Inmunología (IZI), Rama de Bioanálisis y Bioprocesos (IZI-BB), Am Mühlenberg 13, 14476, Potsdam, Alemania

Anne Zemella, Jeffrey L. Schloßhauer, Ruben M. Walter y Stefan Kubick

Instituto de Química y Bioquímica-Bioquímica, Universidad Libre de Berlín, Takustr. 6, 14195, Berlín, Alemania

Jeffrey L. Schloßhauer y Stefan Kubick

Instituto de Biotecnología, Universidad Técnica de Berlín, Gustav-Meyer-Allee 25, 13355, Berlín, Alemania

Rubén M. Walter

Facultad de Ciencias de la Salud, Facultad conjunta de la Universidad Tecnológica de Brandeburgo Cottbus-Senftenberg, la Facultad de Medicina de Brandeburgo Theodor Fontane y la Universidad de Potsdam, Potsdam, Alemania

Stefan Kubick

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PP: conceptualización, curación de datos, análisis formal, investigación, metodología, validación, visualización, redacción; AZ: conceptualización, curación de datos, análisis formal, investigación, metodología, validación, visualización, redacción; JLS: curación y revisión de datos; RMW: curación de datos, revisión, SK: conceptualización, adquisición de fondos, administración de proyectos, recursos, supervisión, validación, revisión, edición, RH: conceptualización, adquisición de fondos, administración de proyectos, recursos, supervisión, validación, revisión, edición

Correspondencia a Anne Zemella o Rainer Haag.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Pouyan, P., Zemella, A., Schloßhauer, JL et al. Comparación uno a uno de conjugados de eritropoyetina sintetizados libres de células modificados con poliglicerol lineal y polietilenglicol. Representante científico 13, 6394 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33463-x

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Recibido: 25 de enero de 2023

Aceptado: 13 de abril de 2023

Publicado: 19 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33463-x

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