Seguridad, aceptabilidad y farmacocinética de un anticuerpo monoclonal.

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Artículo de investigación

Roles Conceptualización, Curación de datos, Análisis formal, Adquisición de fondos, Investigación, Metodología, Administración de proyectos, Supervisión, Validación, Visualización, Escritura: borrador original, Escritura: revisión y edición.

* Correo electrónico: [email protected], [email protected]

¶‡ Estos autores comparten la primera autoría de este trabajo.

Afiliación Facultad de Medicina de la Universidad de Boston, Departamento de Medicina, Boston, Massachusetts, Estados Unidos de América

https://orcid.org/0000-0002-7022-0135

Roles Conceptualización, Adquisición de fondos, Investigación, Metodología, Administración de proyectos, Recursos, Supervisión, Redacción – revisión y edición.

¶‡ Estos autores comparten la primera autoría de este trabajo.

Afiliación Facultad de Medicina Alpert de la Universidad de Brown, Departamento de Obstetricia, Ginecología y Medicina, Providence, Rhode Island, Estados Unidos de América

Roles Conceptualización, Adquisición de fondos, Investigación, Metodología, Administración de proyectos, Recursos, Validación, Redacción: revisión y edición.

Afiliación Mapp Biopharmaceutical Inc., San Diego, California, Estados Unidos de América

Roles Investigación, Metodología, Administración de proyectos, Supervisión, Validación, Redacción – revisión y edición

Afiliación División de Enfermedades Infecciosas, Facultad de Medicina Alpert de la Universidad de Brown, Providence, Rhode Island, Estados Unidos de América

Conceptualización de roles, curación de datos, investigación, metodología, validación, redacción – revisión y edición

Afiliación Facultad de Medicina de la Universidad de Boston, Departamento de Medicina, Boston, Massachusetts, Estados Unidos de América

Roles Conceptualización, Curación de datos, Análisis formal, Adquisición de fondos, Investigación, Metodología, Administración de proyectos, Supervisión, Validación, Redacción: revisión y edición.

Afiliación Departamento de Psiquiatría y Comportamiento Humano, Facultad de Medicina Alpert de la Universidad de Brown, Providence, Rhode Island, Estados Unidos de América

https://orcid.org/0000-0002-5528-1212

Conceptualización de Roles, Análisis Formal, Metodología, Supervisión, Validación, Redacción – revisión y edición

Afiliación Departamento de Bioestadística, Escuela de Salud Pública de la Universidad de Boston, Boston, Massachusetts, Estados Unidos de América

https://orcid.org/0000-0002-1185-8331

Roles Conceptualización, Adquisición de fondos, Metodología, Administración de proyectos, Recursos, Supervisión, Validación, Redacción – revisión y edición.

Afiliación Mapp Biopharmaceutical Inc., San Diego, California, Estados Unidos de América

Roles Conceptualización, Adquisición de fondos, Investigación, Metodología, Administración de proyectos, Supervisión, Validación, Redacción – revisión y edición.

Afiliación Mapp Biopharmaceutical Inc., San Diego, California, Estados Unidos de América

Roles Conceptualización, Adquisición de fondos, Metodología, Administración de proyectos, Redacción – revisión y edición.

Afiliación Mapp Biopharmaceutical Inc., San Diego, California, Estados Unidos de América

https://orcid.org/0000-0002-6857-1024

Conceptualización de roles, supervisión, validación, redacción – revisión y edición

Afiliación Kelly Government Solutions, contratista del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, Institutos Nacionales de Salud, Departamento de Salud y Servicios Humanos, Rockville, Maryland, Estados Unidos de América

https://orcid.org/0000-0001-9552-789X

Conceptualización de roles, adquisición de fondos, investigación, metodología, validación, redacción: revisión y edición.

Afiliación Facultad de Medicina de Harvard, Departamento de Medicina, Boston, Massachusetts, Estados Unidos de América

https://orcid.org/0000-0001-7460-733X

Roles Conceptualización, Adquisición de fondos, Investigación, Metodología, Administración de proyectos, Recursos, Supervisión, Validación, Redacción – revisión y edición.

Afiliación Mapp Biopharmaceutical Inc., San Diego, California, Estados Unidos de América

https://orcid.org/0000-0003-3856-6803

Roles Conceptualización, Adquisición de fondos, Investigación, Metodología, Administración de proyectos, Recursos, Supervisión, Validación, Redacción – borrador original, Redacción – revisión y edición.

Afiliación Facultad de Medicina de la Universidad de Boston, Departamento de Medicina, Boston, Massachusetts, Estados Unidos de América

La película MB66 es un producto de tecnología de prevención multipropósito (MPT) con anticuerpos monoclonales (mAb) contra el VIH-1 (VRC01-N) y HSV-1 y 2 (HSV8-N). Los mAb se produjeron mediante expresión transitoria en Nicotiana benthamiana (N). Realizamos un ensayo clínico de fase I para evaluar la seguridad, la farmacocinética (PK) y la eficacia ex vivo de dosis únicas y repetidas de MB66 cuando se usan por vía intravaginal.

El ensayo clínico inscribió a mujeres sanas en edad reproductiva y sexualmente abstinentes. En el segmento A, 9 mujeres recibieron una única película MB66 que un médico insertó en el fondo de saco posterior vaginal. En el segmento B, 29 mujeres fueron asignadas aleatoriamente a grupos de películas MB66 (activa) o placebo y se les indicó que insertaran 1 película por vía vaginal durante 7 días consecutivos. Las visitas y el muestreo clínico se realizaron antes de la dosis y en varios momentos después de dosis de película únicas y repetidas. El criterio de valoración principal fue el número de eventos adversos (EA) de grado 2 o superior relacionados con el uso del producto. Los criterios de valoración secundarios incluyeron la velocidad de disolución de la película, la puntuación de Nugent (un sistema de puntuación de la tinción de Gram para diagnosticar la vaginosis bacteriana), el pH vaginal, los resultados de la encuesta posterior al uso, las concentraciones de citocinas en muestras de lavado cervicovaginal (CVL) (evaluadas mediante el ensayo Luminex), las concentraciones de mAb en muestras vaginales. fluido recolectado de 4 sitios (evaluado mediante ELISA) y actividad de neutralización de VIH y HSV de muestras de CVL ex vivo (evaluada mediante TZM-bl y ensayo de reducción de placa, respectivamente).

En general, el producto fue seguro y bien tolerado, y no se registraron efectos adversos graves en ninguno de los segmentos. Los EA en este estudio fueron principalmente de naturaleza genitourinaria y el EA notificado con más frecuencia fue la hematuria microscópica asintomática. No hubo diferencias en el pH vaginal o en las puntuaciones de Nugent ni aumentos significativos en los niveles de citoquinas proinflamatorias hasta 7 días después de la inserción de la película en ninguno de los segmentos o entre los grupos Activo y Placebo. Las encuestas posteriores al uso consideraron que la aceptabilidad y la voluntad de utilizar el producto eran altas.

Se evaluaron las concentraciones de VRC01-N y HSV8-N en las secreciones vaginales a lo largo del tiempo para generar curvas farmacocinéticas. Los niveles de anticuerpos alcanzaron su punto máximo 1 hora después de la dosis de película activa (mediana: 35 μg/ml) y permanecieron significativamente elevados 24 horas después de la primera y séptima película (mediana: 1,8 μg/ml). Al corregir la dilución de la muestra (1:20), las concentraciones de VRC01-N oscilaron entre 36 y 700 μg/ml en el momento de 24 horas, más de 100 veces la CI50 para VRC01 (0,32 μg/ml); Las concentraciones de HSV8-N oscilaron entre 80 y 601 μg/mL, muy por encima del IC50 de 0,1 μg/mL. Las muestras de CVL recogidas 24 horas después de la inserción de MB66 neutralizaron significativamente tanto el VIH-1 como el HSV-2 ex vivo. Las limitaciones del estudio incluyen el pequeño tamaño de la cohorte del estudio y el hecho de que no se recolectaron muestras entre 24 horas y 7 días para la evaluación farmacocinética.

Las aplicaciones intravaginales únicas y repetidas de la película MB66 fueron seguras, bien toleradas y aceptables. Las concentraciones y la bioactividad ex vivo de ambos mAb en las secreciones vaginales fueron significativamente elevadas y, por lo tanto, pudieron brindar protección durante al menos 24 horas después de la dosis. Sin embargo, se necesitan más investigaciones para evaluar la eficacia de la película MB66 en mujeres con riesgo de infección por VIH y VHS. Se podrían agregar anticuerpos adicionales a esta plataforma para brindar protección contra otras infecciones de transmisión sexual (ITS) y contracepción.

ClinicalTrials.gov NCT02579083.

Citación: Politch JA, Cu-Uvin S, Moench TR, Tashima KT, Marathe JG, Guthrie KM, et al. (2021) Seguridad, aceptabilidad y farmacocinética de una película de prevención vaginal multiusos basada en anticuerpos monoclonales (MB66): un ensayo aleatorizado de fase I. PLoS Med 18(2): e1003495. https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1003495

Editor académico:Ann Duerr, Red de Ensayos de Vacunas contra el VIH, ESTADOS UNIDOS

Recibió:29 de junio de 2020;Aceptado:12 de enero de 2021;Publicado:3 de febrero de 2021

Este es un artículo de acceso abierto, libre de derechos de autor, y cualquier persona puede reproducirlo, distribuirlo, transmitirlo, modificarlo, desarrollarlo o utilizarlo de otro modo libremente para cualquier propósito legal. La obra está disponible bajo la dedicatoria de dominio público Creative Commons CC0.

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes para el criterio de valoración principal del estudio se encuentran en el manuscrito y sus archivos de información de respaldo. Los datos subyacentes al resto de los resultados presentados en el estudio están disponibles en Robina Folland (correo electrónico: [email protected]).

Fondos: La financiación principal para este trabajo provino de NIH U19 AI096398 (DJA, TRM, KW), una subvención de los Institutos Nacionales de Salud/Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (https://www.niaid.nih.gov/). Mapp Biopharmaceutical también proporcionó financiación como patrocinador del IND para MB66 y desempeñó un papel en el diseño del estudio, la decisión de publicar y la preparación del manuscrito.

Conflicto de intereses: He leído la política de la revista y los autores de este manuscrito tienen los siguientes intereses en competencia: KJW y LZ son propietarios de Mapp Biopharmaceutical Inc., una empresa que pretende comercializar productos basados ​​en anticuerpos. TRM, TN y MB trabajan para Mapp Biopharmaceutical Inc. Los otros autores han declarado que no existen intereses en competencia.

Abreviaturas: EA, evento adverso; CHO, ovario de hámster chino; CVL: lavado cervicovaginal; HEC, hidroxietilcelulosa; VIH-1, virus de inmunodeficiencia humana tipo 1; HSV-2, virus del herpes simple tipo 2; IVR, anillo intravaginal; mAb, anticuerpos monoclonales; MPT, tecnología de prevención multipropósito; N-9, nonoxinol-9; PK, farmacocinética; ITS, infecciones de transmisión sexual

El virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) y el virus del herpes simple tipo 2 (VHS-2) son dos patógenos de transmisión sexual relativamente comunes y graves. Actualmente, más de 35 millones de personas están infectadas por el VIH-1, que puede causar una inmunodeficiencia grave que puede provocar la muerte [1]. Se estima que 1 de cada 4 adultos ha sido infectado con HSV-2, un patógeno que puede causar ulceraciones genitales, patología grave en los recién nacidos y se asocia con un mayor riesgo de adquisición y transmisión del VIH-1 en hombres y mujeres [2, 3]. Se han introducido medicamentos antivirales para suprimir las concentraciones virales y mejorar algunos de los peores efectos de estos virus, pero las infecciones son incurables. Por lo tanto, se están dirigiendo esfuerzos considerables hacia estrategias de prevención. Hasta la fecha, no existen vacunas eficaces para prevenir la transmisión del VIH o del VHS. Los condones son seguros y eficaces cuando se usan de manera constante y correcta, pero generalmente se perciben como una barrera para la intimidad y el placer sexual y tienen una aceptabilidad relativamente baja tanto entre hombres como entre mujeres [4]. Los medicamentos antivirales, cuando se usan de manera consistente, también pueden reducir significativamente los niveles de VIH y VHS en las secreciones genitales y la transmisión o adquisición viral. Sin embargo, muchas personas no infectadas por VIH/VHS no están motivadas a usar estos medicamentos diariamente para prevenir la infección viral.

Se han probado varios microbicidas tópicos, agentes diseñados para reducir la incidencia de infecciones de transmisión sexual, con resultados en gran medida decepcionantes. El espermicida vaginal de venta libre nonoxinol-9 (N-9) mostró una fuerte actividad antiviral en pruebas de laboratorio debido a sus propiedades detergentes, pero causó daños al epitelio vaginal y no demostró eficacia para prevenir la infección por VIH-1 en ensayos clínicos. 5]. Otros candidatos a microbicidas con mecanismos de acción amplios e inespecíficos, incluidos C31G (Savvy; un detergente), BufferGel (un acidificante), PRO2000 (un polianión), sulfato de celulosa (un polianión) y Carraguard (un polianión) tampoco lograron proteger contra el VIH. -1 infección en ensayos clínicos [5].

Medicamentos más específicos contra el VIH-1 han sido el foco del reciente desarrollo de microbicidas vaginales. Los estudios que evalúan la eficacia del fármaco antirretroviral tenofovir en un gel de hidroxietilcelulosa (HEC) han tenido el mayor éxito. El gel de tenofovir (1%) redujo las infecciones por VIH en un 39% en mujeres africanas de alto riesgo (ensayo CAPRISA 004), cuando el gel se administró dentro de las 12 horas previas al coito y nuevamente dentro de las 12 horas posteriores al coito [5,6], y la eficacia aumentó si los participantes cumplieron al menos el 80%. Sin embargo, el gel de tenofovir al 1% aplicado una vez al día, independientemente del coito (ensayo VOICE) no protegió contra la transmisión del VIH-1 [5,7]. Asimismo, el estudio FACTS 001 que utilizó el régimen de dosificación CAPRISA 004 no logró demostrar eficacia, principalmente debido a los bajos niveles de adherencia medidos objetivamente [5,8]. Los ensayos de fase III de un anillo intravaginal (IVR) que contiene dapivirina (los estudios ASPIRE, RING, HOPE y DREAM) demostraron una protección significativa en general, con una mayor protección en los grupos con mayor cumplimiento [9,10]. Encuestas recientes han demostrado que muchas mujeres prefieren un método pericoital eficaz a corto plazo y preferirían no utilizar medicamentos antirretrovirales para prevenir la infección por VIH [11]. Además, han mostrado una fuerte preferencia por productos de tecnología de prevención multipropósito (MPT) que pueden brindar protección contra varios patógenos de infecciones de transmisión sexual (ITS) con o sin anticoncepción [12-14].

Los anticuerpos se han administrado a personas para la prevención y el tratamiento de enfermedades durante más de un siglo [15]. Recientemente, los anticuerpos monoclonales humanos (mAb) se han convertido en una forma aceptada de tratamiento para diversas enfermedades; Se han autorizado más de 90 mAb para uso clínico en los Estados Unidos y la Unión Europea [16,17]. Actualmente se están administrando mAb potentes y ampliamente neutralizantes específicos del VIH por vía intravenosa o subcutánea en ensayos clínicos para la prevención y el tratamiento del VIH [18]. Los MAb también son prometedores como microbicidas tópicos debido a su especificidad, flexibilidad y perfil de seguridad favorable en general. Las secreciones vaginales humanas contienen varios anticuerpos naturales [19]; por lo tanto, la adición de mAb humanos puede mejorar potencialmente los mecanismos de defensa naturales. Los estudios en primates no humanos demostraron que los mAb anti-VIH protegen contra la transmisión vaginal del VIH cuando se administran por vía sistémica o vaginal inmediatamente antes de la provocación vaginal [15]. Dos ensayos clínicos piloto de fase I realizados en Europa sobre anticuerpos contra el VIH aplicados por vía vaginal [20,21] proporcionaron datos iniciales de que este enfoque es seguro en las mujeres. Hemos desarrollado una película microbicida, MB66, que contiene una combinación de 2 mAb humanos: VRC01 [22], que está dirigido contra el VIH-1, y HSV8 [23], que está dirigido contra HSV-1 y 2. VRC01 es un potente neutralizador del VIH, con una CE50 de <1 μg/mL para la mayoría de un panel de diversos aislados de VIH [24]. HSV8 se une a la glicoproteína D de HSV-1 y 2 y es un potente neutralizador de ambos virus, con una CE50 de <1 μg/ml [25,26]. Se ha demostrado que HSV8 proporciona protección in vivo en el modelo de exposición vaginal de ratón HSV-2, con EC50 y EC90 de 0,1 μg/ml y 1 μg/ml, respectivamente [23]. No ha habido estudios previos del HSV8 en humanos. Los mAb se produjeron utilizando una plataforma Nicotiana benthamiana rápida y rentable [27]. Presentamos aquí el primer ensayo clínico de fase I en humanos de una película vaginal MPT basada en anticuerpos con una serie de criterios de valoración de seguridad y eficacia ex vivo.

El estudio fue aprobado por la División de SIDA del NIAID (DAIDS) y las Juntas de Revisión Institucional tanto del Hospital Miriam (Protocolo de Sujetos Humanos #763714) como del Campus Médico de la Universidad de Boston (Protocolo de Sujetos Humanos #H-34209) y fue registrado en ClinicalTrials. gobierno (NCT N° NCT02579083). Consulte la Lista de verificación S1 CONSORT para obtener detalles sobre ensayos clínicos aleatorios.

MB66-01 es un estudio de fase I para evaluar la seguridad de MB66, una película microbicida vaginal que contiene una combinación de mAb anti-VIH (VRC01-N) y anti-HSV (HSV8-N). El estudio fue coordinado por la Facultad de Medicina de la Universidad de Boston (BUSM) bajo un IND patrocinado por Mapp Biopharmaceutical (San Diego, California, EE. UU.) y realizado en el Hospital Miriam, Providence, Rhode Island, del 18 de enero de 2016 al 23 de julio. , 2018, con datos compilados y analizados en BUSM.

MB66-01 tenía 2 segmentos secuenciales: Segmento A, un estudio de un solo brazo, de dosis única seguido de una pausa para la evaluación de seguridad, y Segmento B, un estudio de dos brazos, de dosis repetidas, aleatorizado, simple ciego y controlado con placebo. ensayo. El segmento B utilizó un diseño de grupo paralelo con una proporción de asignación de 1:1. La asignación aleatoria de los participantes inscritos en el Segmento B al grupo Activo (película MB66) o al grupo de película Placebo (película sin anticuerpos) se realizó en bloques de 6 mediante una lista de números de identificación creados previamente por el estadístico del estudio utilizando el software estadístico SAS (Versión 9.4; SAS Institute, Cary, Carolina del Norte, EE.UU.). El farmacéutico del estudio realizó la asignación aleatoria mediante 2 sobres codificados que contenían películas activas y de placebo. La identidad del grupo permaneció codificada durante todo el ensayo y no fue revelada al personal del estudio hasta que se compilaron todos los datos y se completaron los análisis estadísticos.

El reclutamiento, el consentimiento informado por escrito y la inscripción fueron realizados por médicos del estudio en el Hospital Miriam según el protocolo aprobado por DAIDS (consulte el Protocolo del estudio S1). La inscripción objetivo fue de 8 participantes para el segmento A y 30 participantes (15 por grupo de estudio) para el segmento B. Las mujeres eran elegibles si tenían entre 18 y 45 años de edad, estaban sanas, no estaban infectadas por el VIH, tenían un riesgo bajo de contraer VIH/ITS y tenían ciclos menstruales normales, no estaban embarazadas y utilizaban un método anticonceptivo confiable, y eran mujeres premenopáusicas con el útero intacto. Cabe señalar que no se realizó una detección previa del estado serológico de HSV-1 y HSV-2 ya que se esperaba que solo una minoría de los participantes potenciales fueran seronegativos para ambos virus. Los anticuerpos preexistentes contra HSV-1 y HSV-2 constituyen un antecedente en las pruebas de anticuerpos contra HSV8. Sin embargo, se consideró poco práctico reclutar para el estudio si se requería doble seronegatividad para el VHS además de los demás criterios de inclusión y exclusión. Las listas completas de criterios de inclusión y exclusión se presentan en las tablas S1 y S2, respectivamente.

El producto MB66 contiene 10 mg de cada uno de VRC01-N (mAb anti-VIH-1) y HSV8-N (mAb anti-HSV-2) en una película de alcohol polivinílico (PVA) de 2 x 2 pulgadas (Fig. 1). . En el Segmento A, la dosis de exposición única fue de 1 película. En el segmento B, se administraron 7 dosis diarias de la película Active MB66 o de una película de control Placebo que contenía los mismos excipientes que la película Active.

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1003495.g001

El segmento A constaba de 4 visitas y el segmento B constaba de 5 visitas, ambos con un contacto telefónico de seguridad entre las visitas 3 y 4 (resumido en la figura 2). La Visita 1 fue la Visita de Selección para cada Segmento. A las mujeres se les administró un cuestionario que cubría una variedad de variables relacionadas con la participación en el estudio, incluida la demografía, el historial médico y la elegibilidad. Los posibles participantes también fueron evaluados mediante pruebas de laboratorio (ver Tabla S3) y exámenes físicos y pélvicos. Se recogió una muestra de lavado cervicovaginal (CVL) con un espéculo colocado, utilizando 5 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco dispensada 3 veces a través de una jeringa para lavar las paredes vaginales y el ectocérvix, luego se recogió del fondo de saco posterior. Este CVL sirvió como muestra de referencia para los criterios de valoración secundarios y exploratorios. Durante la visita de selección, las mujeres aceptaron la abstinencia sexual durante 5 días antes de la visita de inscripción hasta 1 semana después de la inscripción y usar condones para las relaciones vaginales durante 2 semanas adicionales después de la visita de salida (Visita 4).

Estudio MB66-01 Esquemas de los segmentos A y B con inscripción objetivo.

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1003495.g002

A los participantes que cumplieron con los criterios de inclusión y exclusión se les programó una Visita de inscripción (Visita 2). La visita de inscripción se programó para que se realizara dentro de las 2 semanas posteriores al último período menstrual para garantizar que no se produjera la menstruación durante ninguna de las visitas del estudio. La participante se sometió a un breve examen físico y un examen pélvico, medición del pH vaginal, prueba de embarazo y análisis de orina. Si no se evidenciaba sangrado u otros hallazgos excluyentes, se inscribía al participante. En el segmento A, el médico del estudio insertó digitalmente la película del estudio en la vagina y registró el momento de la inserción. En el segmento B, la participante fue asignada al azar al producto del estudio, se sometió a una capacitación estandarizada sobre la aplicación del producto del estudio y se insertó su primera dosis de la película del estudio por vía vaginal en presencia del médico del estudio. 1, 4 y 24 horas después de la inserción inicial de la película, el médico del estudio insertó un espéculo y calificó el grado de hidratación de la película (conversión de una película sólida a una consistencia gelatinosa blanda) y su posterior desaparición completa (disolución). Se hicieron estimaciones del grado de disolución del gel utilizando una escala que oscila entre el 100% (disolución total) y el 0% (sin disolución evidente).

La visita 3 (visita de seguimiento: día 1) se produjo al día siguiente. Los participantes del segmento B recibieron 8 dosis (incluidas 2 dosis adicionales) del producto del estudio en viales MEMS Cap (monitoreo de la adherencia) (Grupo AARDEX, Lieja, Bélgica) para ser administrados en casa.

Desde la Visita 3 hasta el final del estudio, se evaluaron criterios de valoración de seguridad y eventos adversos (EA) en los participantes de ambos segmentos. Además, se obtuvieron análisis de orina, estimaciones de disolución de películas y mediciones de pH vaginal, CVL y otras evaluaciones de laboratorio (consulte las tablas S1-S3). Se obtuvieron muestras absorbidas de sangre y tiras de papel de filtro vaginal (TearFlo, Beaver-Visitec International, Waltham, Massachusetts, EE. UU.) para evaluar los niveles de mAb y su distribución dentro del fluido vaginal a lo largo del tiempo; muestreo en el orificio cervical, el exocérvix y la vagina media y distal. Los morfotipos bacterianos se evaluaron en todas las visitas mediante la puntuación de Nugent en frotis vaginales teñidos con Gram [28]. Además, los participantes del Segmento B completaron una evaluación de comportamiento que capturaba datos de aceptabilidad de la película, voluntad de uso (WTU) y percepción sensorial después del uso final de la película (Visita 4).

El objetivo principal del ensayo clínico fue evaluar la seguridad de la película MB66 registrando la incidencia de EA de grado 2 o superior que se consideran relacionados con el producto del estudio (versiones actuales de la tabla de clasificación de genitales femeninos de DAIDS para uso en estudios de microbicidas y la tabla de clasificación). la gravedad de los acontecimientos adversos en adultos y niños [29,30]). La seguridad se evaluó durante todo el estudio mediante el seguimiento de los EA, los signos vitales y los valores de laboratorio clínico, la realización de exámenes físicos y la revisión de los medicamentos y procedimientos concomitantes. Todos los EA fueron revisados ​​por el Equipo de revisión de seguridad del protocolo y analizados independientemente de su gravedad o relación con los productos del estudio.

Los objetivos secundarios incluyeron: tasa de disolución de la película MB66, concentraciones vaginales de anticuerpos MB66 y concentraciones sanguíneas de anticuerpos MB66.

Los objetivos exploratorios incluyeron: efectos antivirales ex vivo de los anticuerpos MB66 en el líquido CVL de los participantes después de la dosificación con película MB66, efectos de MB66 en el ambiente microbiano cervicovaginal según lo determinado por la puntuación de Nugent de frotis vaginales teñidos con Gram, efectos de la película MB66 sobre la inflamación vaginal y inmunidad innata midiendo los niveles de citoquinas proinflamatorias y mediadores inmunes en CVL antes y después del uso de la película, y la aceptabilidad de la película vaginal MB66 después de 7 días de uso.

Se utilizó un protocolo de neutralización estándar de TZM-bl [31] para evaluar la neutralización de 3 cepas diferentes de VIH-1: Q23-17 (aislado de clado primario A, R5, Nivel 2), BaL (cepa de clado B adaptada en laboratorio, R5, Nivel 1) y LAI (cepa de clado B adaptada al laboratorio, X4, Nivel 1). Las reservas virales fueron proporcionadas amablemente por el Dr. Manish Sagar, Facultad de Medicina de la Universidad de Boston. Para los ensayos de neutralización se utilizaron muestras de CVL, recogidas al inicio y en varios momentos después del uso de la película Active o Placebo; Las pruebas se realizaron por triplicado. Se mezclaron cepas individuales de VIH-1 (500 IP en 25 µl) con 25 µl de muestra de CVL y se incubaron durante 1 hora. Luego se agregaron muestras a 1 x 104 células TZM-bl (NIH AIDS Reagent Program, Germantown, Maryland, EE. UU.) que se suspendieron en 50 μL de medio de cultivo de tejidos en placas de 96 pocillos. Se dejó que la infección continuara durante 48 horas y las muestras se procesaron con un ensayo de β-galactosidasa (Galacto-Star, Thermo Fisher Scientific, Bedford, Massachusetts, EE. UU.). La luminiscencia en RLU se registró en un lector de microplacas (Synergy HTX, BioTek, Winooski, Vermont, EE. UU.). Las células TZM-bl infectadas (tratadas solo con virus) sirvieron como controles positivos, y las células TZM-bl no infectadas (sin virus) sirvieron como controles negativos.

Para la neutralización del HSV-2, se utilizó la prueba de neutralización por reducción de placa del HSV-2 [32]. Se sembraron células Vero (riñón de mono verde africano) (ATCC, Manassas, Virginia, EE. UU.) en una placa de 96 pocillos a 5.000 células/pocillo y se incubaron durante 18 a 24 horas a 37 °C hasta una confluencia del 75 % al 80 %. La cepa G de HSV-2 (ATCC; 1000 TCID50 en 25 µl de DMEM) se incubó con 25 µl de muestra de CVL durante 1 hora; cada prueba se realizó por triplicado. Luego se añadió la mezcla de virus y anticuerpos a los cultivos de células Vero y se incubó durante 12 a 15 horas a 37°C. Luego se lavaron las células para eliminar el exceso de virus y se incubaron adicionalmente durante 4 días. Las placas se contaron utilizando un microscopio de contraste de fase invertida. Las células Vero infectadas (solo virus) sirvieron como controles positivos, mientras que las células Vero no infectadas (sin virus) sirvieron como controles negativos.

Luminex (Bio-Plex MAGPIX, Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, EE. UU.) analizó alícuotas de CVL de varias visitas de estudio en los segmentos A y B (consulte la figura 2 para conocer los momentos exactos) en busca de citocinas que se han asociado con el VIH. transmisión [33–38], utilizando un kit multiplex Invitrogen ProcartaPlex personalizado (ThermoFisher, Waltham, Massachusetts, EE. UU.) según el protocolo del fabricante. Los analitos incluyeron: TNF-1α, IL-6, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, SDF-1α, IL-8, MCP-1, IP-10, GM-CSF, IFN-γ, IL-10 e IL-12p40.

Las concentraciones de VRC01-N en muestras de CVL y TearFlo (Fig. 2) se midieron mediante inmunoensayo de electroquimioluminiscencia validado. Las concentraciones de HSV8-N en muestras CVL y TearFlo se midieron mediante ELISA colorimétrico.

Los participantes del segmento B completaron una evaluación de comportamiento a través del formato de autoentrevista asistida por computadora (ACASI) que captura datos de aceptabilidad de la película, WTU y percepción y experiencia sensorial del usuario (USPE). Los ítems de WTU evaluaron las probabilidades de uso futuro en indicaciones de propósito único y múltiple. Las escalas USPE capturaron experiencias sensoriales específicas provocadas por el uso de películas. Solo se incluyeron en esta evaluación participantes totalmente evaluables (n = 24) porque habían completado el estudio y, por lo tanto, habían tenido una exposición total al producto del estudio.

Los datos de los participantes se ingresaron en una base de datos (StudyTRAX, Macon, Georgia, EE. UU.) en una computadora protegida con contraseña. Las variables discretas se analizaron mediante pruebas exactas de Fisher. La mayoría de las variables continuas se analizaron mediante análisis de varianza de medidas repetidas (ANOVA) con la corrección de Geisser y Greenhouse para controlar las desviaciones en la esfericidad o mediante análisis de modelo lineal mixto. Un efecto significativo fue seguido por pruebas de comparación múltiple de Tukey (para ANOVA) o Tukey-Kramer (para modelo lineal mixto). Si las variables continuas no tenían una distribución normal, se transformaban logarítmicamente (naturales) antes del análisis. Se realizaron pruebas t no pareadas o pruebas U de Mann-Whitney para comparaciones de 2 grupos de algunas variables continuas. Se realizaron coeficientes de correlación de rangos de Spearman para evaluar las relaciones entre variables. Se asumió significación estadística cuando p < 0,05. Los análisis se realizaron con SAS (Versión 9.4), JMP Pro (Versión 14.1.0) (ambos del SAS Institute, Cary, Carolina del Norte, EE. UU.) y Prism (Versión 8.3.1; GraphPad Software, La Jolla, California, EE. UU.) . Con respecto a los datos de WTU y USPE, se calcularon las medias de respuesta para cada grupo evaluable. Para comprender las diferencias de USPE entre grupos, realizamos comparaciones de las puntuaciones medias promediadas de la escala de elementos de USPE para determinar las diferencias en el tamaño del efecto de Hedges g entre grupos [39].

Para el criterio de valoración principal (EA de Grado 2 o superior considerado relacionado con el producto del estudio), todos los participantes inscritos se incluyeron en el análisis (intención de tratar) porque todos estuvieron expuestos a al menos 1 película y era posible que un EA pudiera tener sido responsable de que un participante se retirara anticipadamente del estudio. Para los criterios de valoración secundarios y exploratorios (es decir, concentraciones de anticuerpos, citoquinas, neutralización viral ex vivo, etc.), solo se incluyeron en los análisis participantes completamente evaluables. Los participantes del segmento A totalmente evaluables se definieron como aquellos que completaron las visitas de selección e inscripción y regresaron para la visita del día 1. Los participantes del segmento B totalmente evaluables se definieron como aquellos que completaron las visitas de selección e inscripción, regresaron para la visita 4 y, según las grabaciones MEMS, habían utilizado el producto del estudio durante al menos 5 de los 7 días anteriores, incluido el día anterior a la presentación.

En el segmento A, se evaluó a 17 mujeres para inscribir a 9 participantes, 8 de las cuales completaron el estudio (completamente evaluable). En el segmento A, la inelegibilidad después de la evaluación (n = 8) se debió a: lapso del período de inscripción (n = 2), prueba de alanina aminotransferasa anormal (n = 1), alergia al látex (n = 1), análisis de orina anormal (n = 1) , control de la natalidad inadecuado/prueba de Trichomonas positiva (n = 1), prueba de Papanicolaou anormal (n = 1) y prueba de Trichomonas positiva/análisis de orina anormal (n = 1). Consulte la Tabla 1 para conocer las características iniciales y la Figura 3A para ver el desglose de la inscripción.

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1003495.g003

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1003495.t001

En el segmento A, se informaron 8 EA en 3 de los 9 participantes (consulte la Tabla 2, las Tablas S4 y S6 para obtener más detalles). Todos los EA menos uno tuvieron una clasificación de gravedad de 1; un EA con picazón vaginal tuvo una gravedad de grado 2. Tres EA de grado 1 y ningún EA de grado 2 o superior se clasificaron como relacionados con el producto del estudio. Luego de una evaluación realizada por el Equipo de Revisión de Seguridad del Protocolo, se permitió que MB66-01 pasara al Segmento B.

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1003495.t002

En el segmento B, se examinó a 47 mujeres para inscribir a 29 participantes que fueron asignadas aleatoriamente a grupos de películas Activo (n = 15) o Placebo (n = 14). Para este segmento, la inelegibilidad después de la evaluación (n = 18) se debió a: lapso del período de inscripción (n = 6), prueba de Trichomonas positiva (n = 2), no hay prueba de Papanicolaou disponible (n = 2), medicamentos no permitidos (n = 4) , prueba de embarazo positiva (n = 1), menstruaciones irregulares (n = 1), edad (n = 1) y no estable médicamente (n = 1). De las mujeres inscritas, 5 no fueron completamente evaluables debido al uso incompleto de la película como resultado de EA (3 mujeres) o el incumplimiento del programa de inserción de la película (2 mujeres; según lo determinado por los registros MEMS Cap). De las 3 mujeres que no fueron completamente evaluables debido a EA, solo 1 estaba en el grupo de película activa. Además, se determinó que solo uno de los AA en estas 3 mujeres estaba relacionado con el producto y ocurrió en el grupo de películas Placebo. Esto dejó a 13 mujeres totalmente evaluables en el grupo de cine Activo y 11 en el grupo de cine Placebo. Consulte la Figura 3B para ver el desglose de la inscripción y la Tabla 1 para conocer las características iniciales. Los datos demográficos coincidieron con los de la población de pacientes del Hospital Miriam y no difirieron entre los grupos de películas activas y placebo.

En el segmento B se reportaron 45 EA; 27 en el grupo de cine Activo y 18 en el grupo de cine Placebo. La incidencia de EA ≥ Grado 2 considerados relacionados con el producto del estudio no difirió significativamente entre los grupos Activo y Placebo [2/15 (13,3%) versus 1/14 (7,1%), p = 1,00]. Una comparación exhaustiva de los EA en los grupos de películas activas y de placebo no reveló diferencias significativas entre los grupos (Tabla 2, Tablas S5 y S6).

La figura S1 muestra la disolución de la película MB66 en varios momentos después de la inserción de una sola película en el segmento A y la inserción de las películas 1 y 7 en el segmento B. Todas las películas del estudio estaban completamente hidratadas y se habían transformado en forma de gel 1 hora después de la inserción. En el segmento A, se observó una disolución sustancial (>50%) de la película en todos los participantes 1 hora después de la inserción de la película (Figura S1A). En el segmento B, las películas MB66 y Placebo se disolvieron en gran medida 4 horas después de la inserción. No hubo diferencias significativas en las tasas de disolución entre los grupos de películas activas y de placebo o después de la inserción de 1 frente a 7 películas (Figura S1B).

En el segmento A, no hubo diferencias significativas en el pH vaginal el día 0 (antes de la inserción de la película MB66) en comparación con las 24 horas y 7 días posteriores a la inserción de una sola película (Figura S2A). De manera similar, en el Segmento B, no hubo diferencias significativas en el pH vaginal entre las visitas (después de las inserciones iniciales y repetidas de la película) o entre los grupos de película Activa y Placebo (Figura S2B).

En el segmento A, no hubo diferencias significativas en las puntuaciones de Nugent el día 0 (antes de la inserción de la película MB66) en comparación con las 24 horas y 7 días posteriores a la inserción de una sola película (Figura S3A). De manera similar, en el Segmento B, no hubo diferencias significativas en las puntuaciones de Nugent entre las visitas (después de la inserción inicial y repetida de películas) o entre los grupos de películas Activas y Placebo (Figura S3B).

VRC01-N: en el segmento A, las concentraciones de VRC01-N en las muestras de TearFlo estuvieron significativamente elevadas en los 4 sitios cervicovaginales 1 hora y 4 horas después de la inserción de una película única en comparación con el valor inicial. Las concentraciones de MAb en muestras de orificio cervical y ectocérvix permanecieron significativamente elevadas 24 horas después de la inserción de la película, mientras que las concentraciones en muestras de vagina media y distal no se elevaron significativamente 24 horas después de la inserción de la película (Fig. 4A). En el segmento B, 96 muestras de película de placebo TearFlo de 8 participantes (4 sitios vaginales; línea de base, puntos de tiempo de 1, 4 y 24 horas) estuvieron por debajo de la detección de VRC01-N. Para el grupo de película activa, las concentraciones de mAb en los 4 sitios vaginales se elevaron significativamente 1 y 4 horas después de la inserción de la primera película en comparación con el valor inicial (p <0,001). Aunque las concentraciones en los 4 sitios disminuyeron desde los valores máximos a las 24 horas después de la inserción de la película, permanecieron significativamente elevadas en comparación con el valor inicial (Fig. 4C).

Concentraciones de VRC01-N y HSV8-N (representadas por medianas con rangos intercuartílicos) en muestras cervicovaginales de TearFlo en los segmentos A y B (solo grupo de película activa). (A). Segmento A, VRC01-N: Los 4 sitios se elevaron significativamente 1 hora (p < 0,001 para todas las comparaciones de sitios) y 4 horas (p < 0,001 para los sitios del orificio cervical, ectocérvix y vagina media; p = 0,007 para la vagina distal) después inserción de una sola película en comparación con las respectivas concentraciones iniciales. El orificio cervical (p = 0,046) y el ectocérvix (p = 0,02) estaban elevados 24 horas después de la inserción de la película. La vagina media (p = 0,09) y distal (p = 0,54) no estaban significativamente elevadas 24 horas después de la inserción de la película. (B). Segmento A, HSV8-N: Todos los sitios estaban significativamente elevados 1 hora y 4 horas después de la inserción de la película única (p <0,001 para todas las comparaciones), pero no en el momento de las 24 horas. (C). Segmento B, VRC01-N: Los 4 sitios estuvieron significativamente elevados a las 1 (p < 0,001 para todas las comparaciones de sitios) y 4 (p < 0,001 para todas las comparaciones de sitios) horas después de la inserción de la primera película en comparación con la concentración inicial respectiva de cada sitio. Las concentraciones en los 4 sitios 24 horas después de la primera película y 24 horas después de la séptima película permanecieron significativamente elevadas en comparación con el valor inicial (p < 0,001 para los sitios de la vagina distal, el ectocérvix y la vagina media y p = 0,01 para el orificio cervical para el valor inicial versus 24 horas después primera película, y p < 0,001 para la vagina distal, el ectocérvix y los sitios de la vagina media y p = 0,0007 para el orificio cervical para la línea de base versus 24 después de la séptima película). (D). Segmento B, HSV8-N: Los 4 sitios estaban significativamente elevados 1 y 4 horas después de la inserción de la primera película en comparación con las concentraciones iniciales. Las concentraciones en los 4 sitios 24 horas después de la primera película y 24 horas después de la séptima película permanecieron significativamente elevadas en comparación con el valor inicial (p <0,001 para todas las comparaciones).

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HSV8-N: en el segmento A, todos los sitios estaban significativamente elevados para HSV8-N 1 hora y 4 horas después de la inserción de la película única (p <0,001 para todas las comparaciones), pero no en el momento de las 24 horas (Fig. 4B). En el segmento B, las muestras de película activa y placebo se incluyeron en el análisis estadístico de las concentraciones de muestras de HSV8-N TearFlo. Para el grupo de película activa, las concentraciones de mAb se elevaron significativamente en los 4 sitios cervicovaginales 1 y 4 horas después de la inserción de la primera película en comparación con las concentraciones iniciales (p <0,001 para todas las comparaciones). Al igual que en el análisis VRC01-N, aunque las concentraciones en los 4 sitios disminuyeron en el momento de 24 horas después del uso de la primera y séptima película, permanecieron significativamente elevadas en comparación con el valor inicial (p <0,001 para todas las comparaciones; Fig. 4D). Además, todos los puntos de tiempo posteriores a la película, excepto 7 días después de la séptima película, fueron significativamente mayores para la película Activa en comparación con sus homólogos de la película Placebo para los 4 sitios (p <0,01 para todas las comparaciones). Las muestras iniciales no difirieron significativamente entre los grupos de películas activas y placebo.

Debido a que la disolución de la película fue incompleta al cabo de 1 hora en varios participantes del segmento B, examinamos la relación entre la disolución de la película y las concentraciones de anticuerpos. Por lo tanto, realizamos coeficientes de correlación de rango de Spearman entre la disolución de la película en 1 hora (%) y las concentraciones de VRC01-N y HSV8-N en 1 hora en los 4 sitios cervicovaginales de TearFlo en los participantes del segmento B. Todos los coeficientes de correlación entre la disolución de la película y las concentraciones de anticuerpos fueron <0,30 con valores de p> 0,35. Por lo tanto, en las muestras del segmento B, no hubo relación detectable entre la disolución de la película y la concentración de anticuerpos.

Las concentraciones séricas de VRC01-N en el segmento A (visitas 1, 3 y 4) y el segmento B (visitas 1, 3, 4 y 5 para los participantes de la película activa) estuvieron todas por debajo del límite inferior de cuantificación del ensayo (25 ng/ ml).

Se recolectaron muestras de CVL en momentos específicos (línea de base, 24 horas y 7 días después de la inserción de la película) para proporcionar material suficiente para las concentraciones de mAb, ensayos de neutralización de virus y evaluación de citocinas y quimiocinas proinflamatorias.

En el segmento A, las concentraciones de VRC01-N en las CVL aumentaron significativamente 24 horas después de la inserción de la película única en comparación con la visita inicial 1 (p = 0,006), pero a los 7 días después de la inserción de la película, las concentraciones de mAb habían regresado a los valores iniciales. (Figura 5A). En el segmento B, las muestras de CVL de 8 participantes que recibieron una película de placebo no contenían niveles detectables de VRC01-N en ningún momento. Para el grupo de película activa, las concentraciones de VRC01-N en CVL se elevaron significativamente 24 horas después de los puntos temporales de inserción de la primera y séptima película en comparación con el valor inicial p <0,001); a los 7 días después de la séptima película, los niveles de VRC01-N habían regresado al valor inicial (Fig. 5C).

Neutralización viral y farmacocinética de anticuerpos (representada por medias ± SEM) en CVL en los segmentos A y B (solo grupo de película activa). El porcentaje de neutralización está representado por líneas sólidas/círculos () (eje y izquierdo), y la concentración de anticuerpos está representada por líneas discontinuas/triángulos abiertos () (eje y derecho) en cada gráfico. (A). La concentración de VRC01-N y la neutralización de VIHQ23-17 en el segmento A aumentaron significativamente 24 horas después de la inserción de la película única en comparación con el valor inicial (p = 0,006 y 0,01, respectivamente) y 7 días después de la inserción de la película única (p = 0,006 y 0,02, respectivamente). ). (B). Las concentraciones de HSV8-N en el segmento A aumentaron significativamente 24 horas después de la inserción de la película única en comparación con el valor inicial (p = 0,04) y 7 días después de la inserción de la película única (p = 0,01). Todas las muestras de CVL de 24 horas después de la inserción de la película mostraron una neutralización del HSV del 100 %; sin embargo, el valor p de la prueba F general no alcanzó significación estadística (p = 0,052). (C). La concentración de VRC01-N y la neutralización de VIHQ23-17 en el segmento B aumentaron significativamente 24 horas después de la primera película y 24 horas después de la séptima película en comparación con el valor inicial (p <0,001 para todas las comparaciones). (D).En el segmento B, las concentraciones de HSV8-N 24 horas después de la primera película y 24 horas después de la séptima película no difirieron significativamente del valor inicial (p = 0,056, interacción grupo x visita), pero la neutralización del HSV aumentó significativamente 24 horas después de la primera película (p = 0,003) y 24 horas después de la séptima película en comparación con el valor inicial (p = 0,001).

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Se observó un patrón similar para las concentraciones de HSV8-N. En el segmento A, las concentraciones de HSV8-N en CVL aumentaron significativamente 24 horas después de la inserción de una sola película en comparación con el valor inicial (visita 1) (p = 0,04), pero no fueron significativamente diferentes de los valores iniciales en el momento de 7 días después de la película (p = 0,64) (Figura 5B). En el segmento B, las muestras de película activa y de placebo se incluyeron en el análisis estadístico de las concentraciones de CVL de HSV8-N, ya que algunas de las CVL de película de referencia y de placebo tenían títulos detectables de HSV, probablemente debido a la presencia de anticuerpos naturales anti-HSV en el HSV. -mujeres infectadas. Las concentraciones de anticuerpos en muestras de CVL de participantes de la película activa recolectadas 24 horas después del primer y séptimo uso de la película MB66 fueron elevadas, pero no alcanzaron significación estadística en comparación con las muestras iniciales y de placebo (interacción grupo x visita, p = 0,056) (Fig. 5D).

En el segmento A, las CVL obtenidas de mujeres 24 horas después de la inserción de una sola película neutralizaron significativamente el aislado primario de VIH de Nivel 2 VIHQ23-17 [significativamente diferente del valor inicial (p = 0,01)]; sin embargo, la actividad neutralizante ya no era detectable 7 días después de la inserción de la película [p = 0,99; Figura 5A]. La neutralización CVL de 2 cepas de VIH de Nivel 1 adaptadas en laboratorio, VIHBaL y VIHLAI, mostró el mismo patrón (S4 Fig). De manera similar, en el segmento B, las CVL del grupo de película activa recopiladas 24 horas después de la inserción de 1 o varias películas neutralizaron significativamente el VIHQ23-17 (p < 0,001 para ambos en comparación con el valor inicial), pero las CVL recopiladas 7 días después de la inserción de una o varias películas no neutralizó (Fig. 5C). Se observaron patrones de neutralización similares para VIHBaL y VIHLAI (Figura S5). La neutralización del VIH se correlacionó con la concentración de mAb del VIH (Fig. 5).

En el segmento A, todas las muestras de CVL recolectadas 24 horas después de la inserción de una sola película mostraron una neutralización del 100 % del HSV-2; sin embargo, el valor p de la prueba general F para el ANOVA para la neutralización del HSV-2 no alcanzó significación (p = 0,052) debido al pequeño tamaño de la muestra y a la actividad de neutralización en algunas de las muestras de referencia (Fig. 5B y Fig. S4). En el segmento B, las CVL del grupo de película activa neutralizaron significativamente el HSV-2 24 horas después de la primera película y después de la séptima película [p = 0,004 y p = 0,001 en comparación con el valor inicial, y p = 0,001 y 0,0007 en comparación con el placebo (Figura S5) ]. Los CVL recolectados 7 días después de la inserción diaria de 7 películas no se neutralizaron (p = 0,1; Fig. 5D y S5 Fig).

En el segmento A, los niveles de citoquinas proinflamatorias asociadas con la transmisión del VIH no aumentaron significativamente en las CVL 24 horas después de la inserción de una sola película (Fig. 6A). Específicamente, no hubo diferencias estadísticamente significativas en las concentraciones de 11 de 15 citocinas medidas, incluidas las citocinas proinflamatorias clave, IL-1β, TNF-α, IL-8, MCP-1 e IP-10 en las 3 visitas [Valor inicial ( predosis), 24 horas y 7 días después de la película única]. Curiosamente, las concentraciones de IL-1α, IL-6, MIP-1α y MIP-1β se redujeron significativamente al menos un momento después del uso de la película en comparación con el valor inicial. La proporción de IL-1RA a IL-1, una medida antiinflamatoria ajustada [40–43], fue significativamente mayor 7 días después del uso de la película en comparación con el valor inicial (p = 0,002). Las concentraciones de IL-12p40, IFN-γ y RANTES estuvieron por debajo de la detección para todas las muestras de CVL del segmento A.

Parcelas de bosque de citocinas en CVL: (A).La relación (mediana relativa ± intervalo de confianza del 95%) de la visita 3 (24 horas después de una sola película) a las concentraciones iniciales en el segmento A, y (B).La relación (mediana relativa ± intervalo de confianza del 95 %) entre las concentraciones de la película activa en la visita 4 (24 horas después de la séptima película) y la película de placebo en la visita 4 en el segmento B. No se observaron aumentos significativos en las concentraciones de citoquinas después de la inserción de la película activa o en la película activa versus Comparaciones de grupos de películas de placebo.

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Para el segmento B, el efecto principal del grupo (es decir, película activa versus placebo) no fue significativo para ninguna variable de citoquinas CVL. La figura 6B resume la comparación de las variables de citoquinas CVL para películas activas y de placebo 24 horas después de 7 exposiciones diarias a la película. La mayoría de las citoquinas (IL-10, IL-12p40, IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β, GM-CSF y SDF-1α) no exhibieron efectos principales de grupo o de visita, pero un subconjunto de citocinas exhibió efectos de visita significativos. efectos; en su mayor parte, estos fueron el resultado de reducciones en las concentraciones en comparación con el valor inicial, como se había observado para el segmento A, y generalmente ocurrieron en los grupos de películas activas y de placebo (Figuras S6 y S7). Los niveles de IL-1RA y la relación IL-1RA/IL-1, ambos marcadores de efectos antiinflamatorios, se elevaron significativamente en los grupos de películas activas y de placebo 24 horas después del uso diario de 7 películas en comparación con el valor inicial (Figura S6).

En general, los resultados de los grupos de placebo y de película activa fueron similares con respecto a la disposición a usar. Tres mujeres de los grupos Placebo y Activo respondieron que “probablemente” usarían la película del estudio, mientras que 8 y 10 mujeres, respectivamente, respondieron que “definitivamente” usarían la película. Con respecto a la perceptibilidad, sólo se observó una diferencia estadísticamente significativa entre los datos evaluables: la escala AMB (ambulación): Higiene. La falta de significación estadística no es sorprendente, ya que esperábamos un poder estadístico bajo con tamaños de muestra pequeños en comparación con grupos independientes. Dicho esto, hubo tamaños de efecto notables en las comparaciones de puntuaciones de la escala USPE entre grupos, muchos de ellos en el rango de mediano a grande (las coberturas d de 0,2, 0,5 y 0,8 se consideran efectos pequeños, medianos y grandes, respectivamente). Estos resultados pueden ser indicativos de diferencias importantes entre grupos y deberían reevaluarse en muestras más grandes. Estos se informan en la Tabla 3. En resumen, y con deferencia únicamente al tamaño del efecto, la película Placebo parece haber dado lugar a una mayor aprobación de las preocupaciones de fugas e higiene, mientras que la película Activa fue algo más fácil de insertar y más perceptible para el usuario durante el tratamiento. actividades diarias.

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Los resultados de este ensayo de seguridad de Fase I de MB66 indican que las aplicaciones vaginales únicas y repetidas de una película que contiene una combinación de mAb contra diferentes patógenos de ITS, que se habían producido utilizando una plataforma rápida y rentable a base de plantas, fueron seguras y bien toleradas. y logró concentraciones de anticuerpos en secreciones vaginales capaces de neutralizar los virus VIH-1 y HSV-2 durante al menos 24 horas después de la aplicación de la película.

Dos estudios previos más pequeños evaluaron la seguridad del uso vaginal de mAb contra el VIH en mujeres. Ma y sus colegas [20] probaron la seguridad del mAb neutralizante del VIH 2G12 producido en N. benthamiana, y Morris y sus colegas [21] probaron un gel (MABGEL) que contenía 3 mAb neutralizantes del VIH, 2F5, 4E10 y 2G12, producidos usando Células de ovario de hámster chino (CHO). Ninguno de estos estudios informó efectos adversos graves, y los estudios farmacocinéticos preliminares indicaron que las concentraciones de mAb alcanzaron su punto máximo en las secreciones vaginales después de 1 hora y fueron indetectables 24 horas después de la administración de hasta 28 mg de mAb en solución salina o gel. Nuestro estudio confirma y amplía estos hallazgos, pero también difiere en varios aspectos importantes. Nuestro estudio es el primer ensayo de seguridad en humanos de un producto MPT basado en anticuerpos que contiene mAb contra más de un patógeno de ITS. Además de los criterios de valoración de seguridad clínica, utilizamos secreciones vaginales de los participantes del estudio para demostrar que la película MB66 no incitó una respuesta de citoquinas proinflamatorias relacionada con la susceptibilidad al VIH. Y aunque utilizamos una dosis de mAb más baja que los otros 2 estudios (10 mg frente a un máximo de 28 mg), registramos concentraciones significativas de mAb y actividad de neutralización antiviral en las secreciones vaginales 24 horas después de la inserción de la película (frente a 12 horas en los otros estudios). ) posiblemente atribuible a la formulación de la película. Estos hallazgos recomiendan un mayor desarrollo y prueba de productos MPT basados ​​en mAb.

Hubo una baja incidencia de EA de Grado 2 o superior que se determinó que estaban relacionados con el producto del estudio tanto en el Segmento A (película única) como en el Segmento B (películas múltiples), y el número de EA no difirió entre los grupos de películas Activas y Placebo (Segmento B). El EA más común observado en este estudio fue la hematuria microscópica asintomática. Se informaron un total de 15 EA de hematuria; 4 fueron clasificados como relacionados con el producto del estudio. Seis de los casos ocurrieron antes de la inserción de la película y otros 3 casos estuvieron relacionados con la menstruación. La prueba de laboratorio para hematuria fue extremadamente sensible y la incidencia relativamente alta de hematuria microscópica asintomática en este estudio no se asoció con la exposición al producto del estudio. Algunos de los episodios de hematuria microscópica pueden haberse asociado con traumatismos relacionados con la inserción del producto o procedimientos pélvicos. La mayoría de los participantes con hematuria no tenían otras anomalías genitourinarias. En los segmentos A y B, no hubo diferencias en el pH vaginal o en las puntuaciones de Nugent, ni aumentos significativos en los niveles de citocinas proinflamatorias en las CVL 24 horas después de la inserción de la película activa. Asimismo, en el segmento B, no hubo diferencias significativas en ninguna de estas medidas entre los grupos de películas activas y de placebo después del uso del producto durante 7 días.

Las películas vaginales estaban completamente hidratadas y mostraron una disolución sustancial (desaparición) 1 hora después de la inserción de la película. Se detectaron concentraciones significativas de mAb VRC01-N y HSV8-N en las secreciones vaginales después de la inserción de la película activa. Los niveles de anticuerpos de las muestras de papel de filtro alcanzaron su punto máximo 1 hora después de la dosificación (mediana: 35 μg/ml) y permanecieron significativamente elevados 24 horas después de la primera y séptima película (mediana: 1,8 μg/ml). Teniendo en cuenta la dilución de la muestra (aproximadamente 1:20), las concentraciones de VRC01-N oscilaron entre 36 y 700 μg/ml durante el período de 24 horas, muy por encima del IC50 para VRC01 (0,32 μg/ml) [45]; Las concentraciones de HSV8-N ajustadas para la dilución oscilaron entre 80 y 601 μg/ml durante el período de recolección de 24 horas y se mantuvieron por encima del IC50 para HSV8 (0,1 μg/ml) [46]. La disolución de la película fue incompleta al cabo de 1 hora en varias participantes del segmento B. Sin embargo, no hubo una relación detectable entre la disolución de la película y las concentraciones de anticuerpos en las secreciones vaginales de estas mujeres. VRC01-N fue indetectable en suero después de la inserción de la película, lo que indica que no hay evidencia de absorción sistémica de los mAb aplicados por vía vaginal. Este hallazgo es consistente con el de Morris y colegas [21] y Ma y colegas [20] que informaron que no hubo absorción sistémica detectable de mAb anti-VIH (2F5, 4E10 y 2G12) después de la administración vaginal. La baja absorción sistémica reduce el potencial de inmunogenicidad u otras toxicidades sistémicas de los mAb administrados por vía vaginal.

La disolución de la película pareció ser notablemente mejor 1 hora después de la inserción de una sola película en el segmento A que en el B. Una explicación para esta diferencia podría ser que las películas del segmento A fueron insertadas por el médico del estudio, mientras que las películas del segmento B fueron insertadas por los participantes y pueden No se han colocado tan profundamente. Esta diferencia no pareció tener un efecto sobre las medidas de seguridad o eficacia ex vivo, pero merece atención en estudios futuros.

Se analizaron muestras de CVL recolectadas después de la aplicación de la película MB66 para determinar la concentración de anticuerpos y la eficacia ex vivo en ensayos de neutralización viral para determinar si los anticuerpos conservaban su actividad en el ambiente vaginal. Las muestras de CVL recolectadas 24 horas después de la inserción de películas únicas y múltiples mostraron una neutralización estadísticamente significativa de las 3 cepas de VIH-1 y de HSV-2 (solo segmento B); sin embargo, no se observó neutralización viral al cabo de 7 días, lo que indica que la protección dura al menos 24 horas, pero no 1 semana después de la inserción de la película. En algunas personas, la neutralización modesta del VIH y el VHS observada en muestras basales de CVL puede atribuirse a la activación de mecanismos de defensa vaginales endógenos [47,48]. Sin embargo, en general, hubo más variabilidad en la neutralización del HSV y en las concentraciones de HSV8-N, probablemente debido a anticuerpos anti-HSV endógenos en los participantes seropositivos para HSV-1 y 2. Si bien podría haber sido deseable incluir solo participantes seronegativos para HSV-1 y 2, parece poco probable que la confusión por el estado serológico del HSV influyera sustancialmente en los hallazgos actuales porque las concentraciones de HSV8-N y la neutralización de HSV-2 en las secreciones vaginales aumentaron después de la inserción de la película y disminuyeron. nuevamente después del lavado. De hecho, se observó neutralización del HSV-2 en el 100 % de las muestras en el segmento A después de la inserción de la película. Además, las diferencias en la neutralización del HSV-2 en el segmento B fueron significativas para las comparaciones con el valor inicial o el placebo. Finalmente, debido a que la tasa de seropositividad para HSV es tan alta en mujeres estadounidenses (51% y 16% para HSV-1 y HSV-2, respectivamente), se puede argumentar que se justifica la inclusión de dichas mujeres en este estudio de Fase I [49 ].

La inserción de la película MB66 Active no se asoció con un aumento de citocinas o quimiocinas proinflamatorias en las CVL. De hecho, la inserción de películas (tanto activas como placebo) se asoció con una reducción en las concentraciones de un pequeño subconjunto de citocinas y quimiocinas. Debido a que se ha demostrado que varios geles microbicidas inhiben los ensayos de citoquinas múltiples [33], probamos la interferencia de la película MB66 en el ensayo Luminex pero no observamos un efecto inhibidor sustancial. Dado que en otros estudios se han observado reducciones en las concentraciones de algunas citoquinas en las CVL después de la aplicación de geles microbicidas [33], es posible que la exposición a la película MB66 tenga un efecto sobre el epitelio vaginal o el microbioma; Actualmente estamos examinando estas posibilidades.

La aceptabilidad y la disposición a utilizar el producto se consideraron altas mediante encuestas de perceptibilidad y disposición a utilizar posteriores al uso. Con respecto a la perceptibilidad y, nuevamente, con deferencia a los tamaños del efecto más que a la significación estadística en esta pequeña muestra, hay experiencias de usuarios que se deben considerar en el futuro. Dadas las puntuaciones de fuga e higiene en esta muestra, será importante caracterizar mejor los procesos y propiedades de disolución y miscibilidad de la película Active y determinar si estos impactan la experiencia del usuario y su disposición a usar. También será importante que se controle el efecto de perceptibilidad acumulativa de las inserciones diarias de la película con respecto al cumplimiento continuo en futuros ensayos clínicos. Además, se observó que las mujeres menores de 30 años informaron una puntuación más baja en la escala APP: Facilidad que las mayores, lo que indica un menor respaldo a la facilidad de inserción entre estas mujeres más jóvenes. Dadas las diferencias observadas en la adherencia en ensayos clínicos recientes entre mujeres más jóvenes, creemos que en el futuro se debe enfatizar el aprendizaje de habilidades de inserción [50-52].

Los resultados de nuestro estudio indican que MB66 es seguro y aceptable para las mujeres. Además, los datos ex vivo demostraron una excelente protección antiviral durante al menos 24 horas después de la inserción del producto, lo que proporciona evidencia de que MB66 es un producto MPT prometedor para proteger a las mujeres contra el VIH y el HSV-2. Las limitaciones de nuestro estudio incluyen que no se recolectaron muestras entre 24 horas y 7 días para la evaluación farmacocinética, que las mujeres no fueron examinadas para detectar anticuerpos contra HSV-1 y 2 antes de la inscripción, y que las tasas variables de disolución de la película indican que los participantes pueden requerir capacitación en inserción de productos. . Además, se necesitan más ensayos clínicos para determinar la eficacia clínica y la aceptabilidad en poblaciones de riesgo. Se necesitan más investigaciones para determinar si se necesita más de un anticuerpo anti-VIH para lograr una eficacia óptima y evitar mutaciones de escape del VIH. Por lo tanto, se podrían incluir mAb adicionales contra el VIH-1 y otros patógenos de ITS, así como mAb anticonceptivos [53], en un eventual producto comercial mAb-MPT para proporcionar una protección más completa.

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El porcentaje de disolución no difirió significativamente en el segmento A a lo largo del tiempo (p > 0,10 para todas las comparaciones). En el segmento B, el % de disolución de la película en el momento de 1 hora fue significativamente menor que en todos los demás momentos (p < 0,001 para todas las comparaciones).

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Las diferencias no fueron estadísticamente significativas ni en el segmento A (p = 0,36) ni en el segmento B [efecto principal del grupo (es decir, película activa versus película placebo, p = 0,33) y efecto principal de la visita (p = 0,74)].

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Las diferencias no fueron estadísticamente significativas ni en el segmento A (p = 0,47) ni en el segmento B [efecto principal del grupo (es decir, película activa versus película placebo, p = 0,59) y efecto principal de la visita (p = 0,68)].

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Los ensayos se realizaron por triplicado y los datos se representan como medianas con rangos intercuartílicos. Los asteriscos (*<0,05, **0,02 y ***<0,01) indican diferencias estadísticamente significativas en comparación con el valor inicial mediante la prueba de comparación múltiple de Tukey después de un ANOVA de medidas repetidas significativas.

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Los ensayos se realizaron por triplicado y los datos se representan como medianas con rangos intercuartílicos. Los asteriscos (*) indican diferencias estadísticamente significativas en comparación con el valor inicial y los deltas (Δ) indican diferencias estadísticamente significativas en comparación con los respectivos puntos temporales de Placebo. Consulte el texto para conocer los valores p exactos.

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El efecto principal del grupo (es decir, película activa versus placebo) no fue significativo para ninguna variable de citoquinas CVL. Hubo una serie de efectos de visita significativos (tanto para los grupos de películas activas como para los de placebo). Para TNF-α, el punto de tiempo de 24 horas después de la séptima película fue significativamente mayor que el valor inicial (p = 0,01) o el punto de tiempo de 7 días después de la séptima película (p = 0,02). Para IL-6, el valor inicial fue significativamente mayor que el punto temporal de 24 horas después de la séptima película (p = 0,03). Para IL-1α, el valor inicial y el punto de tiempo de 24 horas después de la primera película fueron significativamente más altos que los puntos de tiempo de 24 horas después de la séptima película y los puntos de tiempo de 7 días después de la séptima película (p <0,001 para todas las comparaciones). Se encontraron resultados similares para IL-1β (p <0,05 para todas las comparaciones). Tanto para IL-1RA como para IL-1RA/IL-1, el punto temporal de 7 días después de la séptima película fue significativamente mayor que los otros 3 puntos temporales (p <0,05 para todas las comparaciones).

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En cuanto a las citoquinas proinflamatorias mencionadas anteriormente, el efecto principal del grupo (es decir, película activa versus placebo) no fue significativo para ninguna variable de quimiocina CVL, y hubo una serie de efectos significativos en las visitas. Para RANTES, el punto de tiempo de 24 horas después de la séptima película fue significativamente mayor que los otros 3 puntos de tiempo (p <0,05 para todas las comparaciones). Para IL-8, la línea de base y el punto de tiempo de 24 horas después de la primera película fueron significativamente más altos que los puntos de tiempo de 24 horas después de la séptima película y los puntos de tiempo de 7 días después de la séptima película (p <0,05 para todas las comparaciones). Para IP-10, el valor inicial fue significativamente mayor que el punto temporal de 24 horas después de la séptima película (p = 0,02). Para MCP-1, la línea de base fue significativamente mayor que el punto de tiempo de 24 horas después de la séptima película solo para el grupo de película activa (p = 0,02).

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Nos gustaría agradecer a las muchas personas que ayudaron en la realización de este ensayo en el Hospital Miriam y el Campus Médico de la Universidad de Boston, incluidas Helen Patterson, Jennifer Brashears, Deborah Good, Melissa L. Getz, Alice Bisbee, Carolyn Finney, Christine Chaisson, Joe Palmisano. , Andrew Vallejo y Manish Sagar. Agradecemos especialmente a Jim Turpin del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID) por su apoyo continuo y entusiasta durante el inicio y la ejecución de este proyecto. Por último, agradecemos a los participantes del estudio por su invaluable contribución a este estudio.

La investigación fue apoyada por el NIAID de los Institutos Nacionales de Salud. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no necesariamente representa las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

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